O cuspe da morte

Post de Deboraci Prates (LIMI-CPqGM/FIOCRUZ)

Saliva de flebotomíneos, neutrófilos e eventos inicias na infecção por Leishmania. (Ilustração de Théo Araújo)

Os neutrófilos constituem a primeira linha de defesa contra infecções. Trabalhos recentes evidenciam cada vez mais a participação dessas células na imunopatogênese das leishmanioses e apontam o recrutamento inicial dessas células no local da picada do vetor (“lago sanguíneo”). A saliva de flebotomíneos constitui uma rica fonte de substâncias farmacologicamente ativas que interferem na resposta imune do hospedeiro. Apesar do reconhecimento da importância de ambos, saliva do vetor e neutrófilos, nos eventos iniciais da infecção pela Leishmania, o papel direto da saliva na interface neutrófilo-parasita ainda não havia sido estudado. Nesse trabalho nós testamos a hipótese de que componentes da saliva de Lutzomyia longipalpis (Lulo), vetor da Leishmania chagasi, induzem a apoptose de neutrófilos e modificam sua resposta inflamatória, favorecendo a infecção. A incubação de neutrófilos peritoneais de camundongos C57BL/6 com a saliva de Lulo deflagrou a apoptose dessas células. Essa morte celular foi dependente da ativação de caspases e mediada por FasL, uma vez que a mesma foi inibida pelo pré-tratamento dos neutrófilos com zVAD (um inibidor pan caspases) e com anticorpo neutralizante anti-FasL. Objetivando avaliar a natureza do componente pró-apoptótico presente na saliva de Lulo e se o(s) mesmo (s) poderia(m) ser alvo(s) de anticorpos específicos, pré-tratamos a saliva com proteinase K e soro imune anti-saliva de Lulo, respectivamente. A apoptose foi revertida em ambos os tratamentos. Nosso próximo objetivo foi o de avaliar a apoptose dos neutrófilos em presença do parasita. Surpreendentemente, aL. chagasi, foi capaz de induzir a morte dos neutrófilos por apoptose, tendo esse efeito acentuado pela saliva. Além disso, em presençada saliva, os neutrófilos apresentaram maior carga parasitária, produziram PGE₂ e tiveram uma redução na produção de espécies reativas de oxigênio. A infecção dos neutrófilos foi associada a apoptose, uma vez que a mesma foi revertida em presença de zVAD. Já a participação da PGE₂ na infecção foi corroborada em ensaios utilizando o inibidor da COX-2, NS-398, nos quais houve aumento da viabilidade dos parasitas. Por fim, avaliamos o potencial infamatório dos neutrófilos infectados em presença da saliva. Esses neutrófilos foram capazes de produzir CCL2/MCP-1 e recrutar macrófagos em ensaios de quimiotaxia in vitro. Tais efeitos foram abolidos pelo pré-tratamento dos neutrófilos com bindarit, um inibidor da expressão de CCL2/MCP-1. Em conjunto, nossos dados são inovadores e promissores. Inovadores por sugerirem um cenário até então não visto no “lago sanguíneo” formado pela picada do vetor e promissores por contribuir para o conhecimento de possíveis eventos iniciais na interface vetor-parasita-hospedeiro nas leishmanioses.

Prates DB, Araújo-Santos T, Luz NF, Andrade BB, França-Costa J, Afonso L, Clarêncio J, Miranda JC, Bozza PT, Dosreis GA, Brodskyn C, Barral-Netto M, Borges VD, & Barral A (2011). Lutzomyia longipalpis saliva drives apoptosis and enhances parasite burden in neutrophils. Journal of leukocyte biology PMID: 21685247

The protective effect against Leishmania infection conferred by sand fly bites is limited to short-term exposure

Rohoušová, I., Hostomská, J., Vlková, M., Kobets, T., Lipoldová, M., & Volf, P. (2011). The protective effect against Leishmania infection conferred by sand fly bites is limited to short-term exposure International Journal for Parasitology DOI: 10.1016/j.ijpara.2011.01.003

Post de Diego Moura-Santos, LIP/CPqGM-FIOCRUZ

A saliva de flebotomíneos contém moléculas anti-hemostáticas e fatores que influenciam a imunidade na pele, além de possuir influência direta no aumento da infecção por Leishmania. Indivíduos expostos à picada do inseto desenvolvem uma resposta imune específica às proteínas salivares. Desta forma, hipotetiza-se que o efeito potencializador da infecção, próprio da saliva, possa ser abolido pela resposta imune em humanos vacinados contra a saliva do vetor. Alguns trabalhos já demonstraram proteção parcial contra infecção por L. major em camundongos imunizados pela picada de vetores não infectados [1,2]. Embora os testes em laboratórios demonstrem que a exposição prévia de animais à saliva do vetor leva a uma infecção mais branda, isto não foi observado em campo. Nas áreas endêmicas a prevalência de vetores infectados com Leishmania é baixa, e os hospedeiros estão comumente expostos à picada do vetor não infectado. Apesar desta contínua exposição, a leishmaniose persiste nas áreas endêmicas. Os habitantes destas áreas desenvolvem uma resposta humoral contra os antígenos da saliva, que está correlacionada com a proteção contra a leishmaniose visceral, mas não com a leishmaniose cutânea. Neste trabalho, os autores avaliaram o efeito protetor conferido pela picada do vetor em diferentes tempos e duração da exposição à picada do flebotomíneo.

Os animais foram expostos à picada do vetor por 2 ou 15 semanas, e sofreram infecção logo após (2 e 15 respectivamente) ou 15 semanas depois (2+0 e 15+0 respectivamente). Apenas o grupo 2 mostrou uma proteção parcial contra infecção por L. major, no qual os animais apresentaram uma menor lesão e menor carga parasitária acumulada (carga da orelha+LN) comparado com os outros grupos. O longo tempo de exposição à saliva do vetor pode ter levado a dessensibilização aos antígenos salivares e a falha na proteção nos grupos 15 e 15+0, assim como ocorre nos habitantes das áreas endêmicas. Todos os grupos mostraram uma elevada produção de anticorpos IgG anti-Leishmania, e o aumento destes anticorpos estavam correlacionados com o tamanho da lesão. Da mesma forma, foi encontrada uma relação entre o tamanho da lesão e o nível de anticorpos IgG anti-P. duboscqi. Desta forma, o grupo 2, que apresentou menor lesão, possuía menor produção de anticorpos IgG anti-Leishmania e IgG anti-P. duboscqi comparado com os outros grupos. Estes resultados estão de acordo com os resultados das áreas endêmicas de leishmaniose cutânea causada por L. braziliensis, onde baixos níveis de anticorpos IgG anti-saliva do vetor foram encontrados em indivíduos sem contato prévio com Leishmania e indivíduos com DTH positivo, mas aparentemente protegidos [3]. Por outro lado, indivíduos com DTH positivo para leishmaniose visceral apresentam elevados níveis de anticorpos IgG anti-saliva do vetor [4].

Os autores concluem que estes resultados podem explicar a persistência da leishmaniose em áreas endêmicas e devem ser levados em consideração no desenvolvimento de vacinas baseadas em proteínas salivares do vetor.

1. Belkaid Y, Kamhawi S, Modi G, Valenzuela J, Noben-Trauth N, et al. (1998) Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. J Exp Med 188: 1941-1953.

2. Oliveira F, Lawyer PG, Kamhawi S, Valenzuela JG (2008) Immunity to distinct sand fly salivary proteins primes the anti-Leishmania immune response towards protection or exacerbation of disease. PLoS Negl Trop Dis 2: e226.

3. de Moura TR, Oliveira F, Novais FO, Miranda JC, Clarencio J, et al. (2007) Enhanced Leishmania braziliensis infection following pre-exposure to sandfly saliva. PLoS Negl Trop Dis 1: e84.

4. Gomes RB, Brodskyn C, de Oliveira CI, Costa J, Miranda JC, et al. (2002) Seroconversion against Lutzomyia longipalpis saliva concurrent with the development of anti-Leishmania chagasi delayed-type hypersensitivity. J Infect Dis 186: 1530-1534.

Marcadores de exposição a picada do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis e detecção da fonte alimentar

Post de Bruno Sangiorgi

A inoculação da saliva durante a picada é um fenômeno comum em insetos hematófagos, e causa, dentre outros efeitos, uma resposta imunológica contra suas proteínas. Esta resposta se caracteriza pela produção de anticorpos específicos contra a saliva do inseto, causando reações alérgicas. A análise dos anticorpos anti-saliva pode ser utilizada em correlações com o risco de desenvolver a doença transmitida pelo vetor e auxiliar a identificação de fontes alimentares. 

Contudo, é impossível testar um grande número de indivíduos usando saliva obtida de flebótomos. Um teste deste tipo necessita ser realizado com proteínas recombinantes. Para que estas relações sejam feitas, é necessária a prévia identificação de proteínas salivares específicas do inseto vetor.

Recentemente foi publicado o trabalho “Discovery of markers of exposure specific to bites of Lutzomyia longipalpis, the vector of Leishmania infantum chagasi in Latin America”. Este estudo teve como objetivo encontrar as proteínas salivares específicas do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, reconhecidas através de análises em soros humanos, de cães e de raposas de São Luís e Teresina, áreas endêmicas para Leishmaniose Visceral. Para tanto, em ensaios de western blot, proteínas recombinantes foram separadas em pesos moleculares distintos, ao hibridizarem com anticorpos policlonais obtidos de modelos murinos. Este padrão de proteínas foi então comparado aos apresentados por ensaios semelhantes, utilizando as proteínas recombinantes previamente obtidas, com os anticorpos presentes nos soros dos organismos abordados no trabalho.

Como resultado, das nove proteínas encontradas na saliva de L. longipalpis, LJM17 e LJM11 foram reconhecidas por soros humanos e de cães, sendo a segunda não reconhecida por soro de raposas (fig. 1). É importante notar que apesar das espécies L. longipalpis e L. intermedia ocorrerem simultaneamente em ambas as regiões, os soros dos organismos não reconheceram as proteínas salivares de L. intermedia. Juntos, estes dados confirmam a especificidade do reconhecimento em cães e humanos das proteínas LJM17 e LJM11, revelando seu alto potencial como marcador molecular a exposição ao inseto vetor.

Fig. 1: Proteínas salivares reconhecidas por soros de humanos, cães e raposas

A identificação destas moléculas representa um avanço no desenvolvimento de ferramentas moleculares como marcadores da exposição ao flebotomíneo L. longipalpis. Um estudo complementar (“Using Recombinant Proteins from Lutzomyia longipalpis Saliva to Estimate Human Vector Exposure in Visceral Leishmaniasis Endemic Areas”) relata o uso destas proteínas em ensaios de ELISA para estimar a exposição a L. longipalpis em 1.077 indivíduos. Em comparação aos ensaios utilizando as proteínas totais do sonicado de glândula salivar(SGS), as proteínas LJM17 e LJM11 foram capazes de detectar a positividade em 77% dos casos (fig. 2), não reagindo com proteínas salivares de outras espécies hematófagas.

Fig. 2: Validação da combinação de r LJM17 e rLJM11 em estimar a exposição de humanos a saliva de L. longipalpis.

Um outro aspecto da alimentação do flebótomo é o fato que anticorpos para estas proteínas podem ser encontradas no soro do hospedeiro vertebradoO fato do hospedeiro vertebrado reconhecer estas proteínas salivares, tornam-nas ferramentas úteis em estudos de detecção das fontes alimentares do flebotomíneo L. longipalpis. Deste modo, material sanguíneo coletado da fauna local, ao ser submetido a hibridização com as proteínas salivares LJM17 e LJM11, evidenciariam a exposição do organismo ao inseto vetor.

Estes estudos atualmente possuem a abordagem da identificação no inseto vetor, a partir da amplificação do DNA do hospedeiro presente no intestino do flebotomíneo. Estas amostras, consideravelmente diminutas e lábeis, são submetidas a PCR multiplex, que nem sempre possuem sucesso em amplificar o material sanguíneo, devido a ação das nucleases intestinais.

 Esta abordagem diferenciada, identificando a fonte alimentar a partir dos anticorpos presentes no hospedeiro, se apresenta como uma poderosa ferramenta nestes estudos, apresentando vantagens quanto a detecção por PCR. Temos como exemplo o conhecimento prévio das espécies amostradas, conferindo uma segurança maior quanto a caracterização da diversidade de espécies escolhidas pelos flebotomíneos. Além disso, a maior duração dos anticorpos no plasma sanguíneo poderá elevar a quantidade de amostras positivas, diminuindo a chance de falsos negativos, possivelmente apresentados pelas amplificações de DNA sanguíneo degradado.

Juntas, ambas as abordagens poderão ser utilizadas de maneira complementar, aumentando nosso conhecimento acerca da ecologia de insetos vetores e possibilitando medidas de controle na densidade de flebotomíneos, a partir de medidas efetuadas nas fontes alimentares.

Teixeira, C., Gomes, R., Collin, N., Reynoso, D., Jochim, R., Oliveira, F., Seitz, A., Elnaiem, D., Caldas, A., de Souza, A., Brodskyn, C., de Oliveira, C., Mendonca, I., Costa, C., Volf, P., Barral, A., Kamhawi, S., & Valenzuela, J. (2010). Discovery of Markers of Exposure Specific to Bites of Lutzomyia longipalpis, the Vector of Leishmania infantum chagasi in Latin America PLoS Neglected Tropical Diseases, 4 (3) DOI: 10.1371/journal.pntd.0000638


Souza, A., Andrade, B., Aquino, D., Entringer, P., Miranda, J., Alcantara, R., Ruiz, D., Soto, M., Teixeira, C., Valenzuela, J., de Oliveira, C., Brodskyn, C., Barral-Netto, M., & Barral, A. (2010). Using Recombinant Proteins from Lutzomyia longipalpis Saliva to Estimate Human Vector Exposure in Visceral Leishmaniasis Endemic Areas PLoS Neglected Tropical Diseases, 4 (3) DOI: 10.1371/journal.pntd.0000649

SANTANNA, M., JONES, N., HINDLEY, J., MENDESSOUSA, A., DILLON, R., CAVALCANTE, R., ALEXANDER, B., & BATES, P. (2008). Blood meal identification and parasite detection in laboratory-fed and field-captured Lutzomyia longipalpis by PCR using FTA databasing paper Acta Tropica, 107 (3), 230-237 DOI: 10.1016/j.actatropica.2008.06.003

Resposta imune humana contra saliva de flebótomos no Entomol 2010

Veja abaixo a apresentação feita ontem, por Aldina, no Entomol 2010.

Marcadores moleculares de exposição a picadas de flebótomos e seu uso com moléculas recombinantes na área endêmica. Trabalhos do LIP e LIMI

Acabam de sair dois trabalhos do LIP e LIMI sobre a resposta do hospedeiro vertebrado às picadas de flebótomos e como esta resposta pode ser utilizada como marcador epidemiológico de exposição. Todos os dois trabalhos resultam de intensa colaboração, entre os laboratórios LIP e LIMI, com os parceiros nacionais do Maranhão e do Piauí, e com colaboradores internacionais, dos EEUU e da Espanha. Há de se registrar também a continuada colaboração com colegas que fizeram doutoramento no LIMI e LIP.

No primeiro trabalho, com Clarissa Teixeira como primeira autora, (Discovery of Markers of Exposure Specific to Bites of Lutzomyia longipalpis, the Vector of Leishmania infantum chagasi in Latin America. PLoS Negl Trop Dis 4(3): e638. doi:10.1371/journal.pntd.0000638) são descritos alguns marcadores de exposição específicos para a Lu. longipalpis. 

Há produtos capazes de funcionar como marcadores no homem e no cão:

“Salivary recombinant proteins are of value as markers of vector exposure. In humans, LJM17 and LJM11 emerged as potential markers of specific exposure to Lu. longipalpis, the vector of Leishmania infantum chagasi in Latin America. In dogs, LJM17, LJM11, LJL13, LJL23, and LJL143 emerged as potential markers of sand fly exposure. Testing these recombinant proteins in large scale studies will validate their usefulness as specific markers of Lu. longipalpis exposure in humans and of sand fly exposure in dogs.”

O passo seguinte seria testar estes marcadores recombinantes em estudos populacionais com amostras maiores.  Este é justamente o trabalho que foi publicado no mesmo número da revista.

O trabalho de Ana Paula (Using Recombinant Proteins from Lutzomyia longipalpis Saliva to Estimate Human Vector Exposure in Visceral Leishmaniasis Endemic Areas PLoS Negl Trop Dis 4(3): e649. doi:10.1371/journal.pntd.0000649), usa populações com diversas características e de diferentes áreas endêmicas para avaliar a utilidade destes marcadores na população e conclui que:

“Our results show the possibility of substituting Lu. longipalpis SGS for two recombinant proteins, LJM17 and LJM11, in order to probe for vector exposure in individuals residing in endemic areas.”

Os resultados são promissores para uso, pois não há reação cruzada com a resposta anti-Lutzomyia intermedia (figura abaixo). 

Teixeira, C., Gomes, R., Collin, N., Reynoso, D., Jochim, R., Oliveira, F., Seitz, A., Elnaiem, D., Caldas, A., de Souza, A., Brodskyn, C., de Oliveira, C., Mendonca, I., Costa, C., Volf, P., Barral, A., Kamhawi, S., & Valenzuela, J. (2010). Discovery of Markers of Exposure Specific to Bites of Lutzomyia longipalpis, the Vector of Leishmania infantum chagasi in Latin America PLoS Neglected Tropical Diseases, 4 (3) DOI: 10.1371/journal.pntd.0000638

Souza, A., Andrade, B., Aquino, D., Entringer, P., Miranda, J., Alcantara, R., Ruiz, D., Soto, M., Teixeira, C., Valenzuela, J., de Oliveira, C., Brodskyn, C., Barral-Netto, M., & Barral, A. (2010). Using Recombinant Proteins from Lutzomyia longipalpis Saliva to Estimate Human Vector Exposure in Visceral Leishmaniasis Endemic Areas PLoS Neglected Tropical Diseases, 4 (3) DOI: 10.1371/journal.pntd.0000649