Vacinação contra leishmania com proteinas ribossomais

Ramírez L, Santos DM, Souza AP, Coelho EAF, Barral A, Alonso C, Escutia MR, Bonay P, de Oliveira CI, Soto M: Evaluation of immune responses and analysis of the effect of vaccination of the Leishmania major recombinant ribosomal proteins L3 or L5 in two different murine models of cutaneous. Vaccine 2013, 31:1312–1319. 

(aqui)

Publicação LIP 2013 

Four new antigenic proteins located in Leishmania ribosomes have been characterized: S4, S6, L3 and L5. Recombinant versions of the four ribosomal proteins from Leishmania major were recognized by sera from human and canine patients suffering different clinical forms of leishmaniasis. The prophylactic properties of these proteins were first studied in the experimental model of cutaneous leishmaniasis caused by L. major inoculation into BALB/c mice. The administration of two of them, LmL3 or LmL5 combined with CpG-oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) was able to protect BALB/c mice against L. major infection. Vaccinated mice showed smaller lesions and parasite burden compared to mice inoculated with vaccine diluent or vaccine adjuvant. Protection was correlated with an antigen-specific increased production of IFN-􏰀 paralleled by a decrease of the antigen-specific IL-10 mediated response in protected mice relative to non-protected controls. Further, it was demonstrated that BALB/c mice vaccinated with recombinant LmL3 or LmL5 plus CpG-ODN were also protected against the development of cutaneous lesions following inoculation of L. braziliensis. Together, data presented here indicate that LmL3 or LmL5 ribosomal proteins combined with Th1 inducing adjuvants, may be relevant components of a vaccine against cutaneous leishmaniasis caused by distinct species. 

Tendencias no Google

É possível fazer comparações de consultas no Google o que pode gerar informações importantes.

O gráfico acima compara as consultas com o termo "leishmaniasis" em azul com "Chagas disease" (vermelho) no mundo todo de 2004 até o presente.

Veja a baixo a comparação entre  "leishmaniasis"em azul com "malaria" com os mesmos parâmetros.

Peptídeos sintéticos para melhorar o imunodiagnóstico das leishmanioses humana e canina

Post de Rayssa Carvalho

A Leishmaniose Visceral é uma zoonose, causada pela Leishmania infantum, que tem como principal hospedeiro o cão. No Brasil, utiliza-se a Imunofluorescência indireta (RIFI) e o ELISA como principais testes diagnósticos. Entretanto, a especificidade e sensibilidade destas técnicas são comprometidas pelo uso de uma complexa mistura de antígenos, que reduz a acurácia destas favorecendo a manutenção de cães doentes, o que tem comprometido o controle da doença que é baseado na eliminação destes. Neste contexto o uso de combinações de antígenos, previamente definidos, aparece como uma alternativa favorável e que pode gerar melhores resultados. 

Com base nisso, o estudo com o título indicado acima do post (doi:10.1371/journal.pntd.0001622), testou combinações de peptídeos derivados de antígenos já utilizados no diagnóstico de Leishmaniose em soros de 106 cães e 44 pacientes humanos.

Os cães foram divididos em três grupos. O primeiro grupo é constituído por 14 soros negativos para leishmaniose; o segundo grupo é formado por soros de cães doentes, sendo 17 sintomáticos e 13 assintomáticos, oriundos de uma mesma área endêmica. O terceiro grupo é formado por 62 amostras, oriunda de diversas áreas endêmicas. Todos os soros foram testados sorologicamente (RIFI e ELISA) e parasitologicamente (PCR e esfregaço de medula óssea). Os soros positivos foram também divididos de acordo com a reatividade na RIFI em: baixa reatividade (n=20)(<1:320);intermediária (n=20)(>1:320<1:640) e alta reatividade (n=22)(>1:640).Os soros humanos foram obtidos de pacientes com Leishmaniose Visceral ativa.

As proteínas A2 (peptídeo 47), NH (peptídeo 17 e 18), LACK (peptídeo 19) e k39 (peptídeo 13) foram selecionadas de epítopos de células B, através de técnicas de bioinformática, e os peptídeos sintéticos derivados destas foram testados por ELISA nos soros selecionados.

Todos os peptídeos foram capazes de detectar os soros positivos tanto de cães sintomáticos como dos assintomáticos. Uma alta sensibilidade (100%) foi detectada em todos os peptídeos quando foram testados, individualmente, em cães com alta reatividade na RIFI. Entretanto, houve uma diminuição dessa sensibilidade, quando foram testados os soros de intermediaria a baixa reatividade na RIFI.

Para testar a hipótese de que a combinação de peptídeos poderia aumentar a sensibilidade do ELISA na detecção de LV, os autores fizeram combinações de dois peptídeos cada, e testaram nos soros de cães com baixa e intermediaria reatividade.

Nos soros com baixa reatividade, os peptídeos 13 e19, e 47 e 18 apresentaram os melhores resultados, com sensibilidade de 95% e especificidade de 100%.

Nos soros humanos selecionados, os peptídeos 17 e 19, individualmente, obtiveram os melhores resultados com uma sensibilidade de 100% e especificidade de 81% e 94%, respectivamente (Tabela 3). A combinação de peptídeos aumentou a sensibilidade e especificidade entre os peptídeos 13 e 19, 18 e 19, e 13 e 47 com sensibilidade de 100% e especificidade variando de 93% e 100% (Tabela 3)

Portanto, a combinação de peptídeos sintéticos identificados a partir de epítopos de células B, pode ser uma ferramenta útil no desenvolvimento de testes sorológicos com alta sensibilidade e especificidade na leishmaniose visceral humana e canina. 

Proteomica para escolha de novos antígenos para vacina e diagnóstico na leishmaniose

Legenda: Superior esquerdo – extrato de promastigotas (Verde)

Superior direito – Amastigotas (Vermelho)

Inferior esquerdo – Padrão / Controle

Inferior direito – Sobreposição de amastigotas e promastigotas (amarelo para sobreposições)

Post de Leonardo Arruda

Com objetivo de identificar novos antígenos, foi publicadono ano passado um trabalho (Analysis of Leishmania chagasi by 2-D Difference Gel Eletrophoresis (2-D DIGE) and Immunoproteomic: Identification of Novel Candidate Antigens for Diagnostic Tests and Vaccine; DOI: 10.1021/pr101286y) que comparou o perfil proteômico de Leishmania chagasi entre proteínas de amastigotas contra promastigotas.

Para isso, os autores utilizaram uma combinação de poderosas ferramentas, como DIGE-2D, Western Blot 2D e MaldiTof, seguidas por uma análise através de softwares. 

Foram visualizados 900 spots, entre amastigotas e promastigotas (figura 1 DIGE-2D). Dentre eles, foram retirados 113 spots para identificação da proteína por Maldi-Tof. Cinco proteínas foram especificamente identificadas como pertencentes a fase amastigota, 25 únicas para a fase promastigota e 10 proteínas identificadas como presentes tanto nas fases amastigota quanto promastigota. Além disso, 41 proteínas foram identificadas usando soro de cães infectados por Western blot 2D, que entre elas, 3 foram reativas a IgM e 38 reativas a IgG total. Os autores também mapearam os epítopos para células B utilizando um arranjo de peptídios com soro de cães. O mapeamento de 180 epítopos para células T CD8+ foi realizado in silico para todas as proteínas reconhecidas por Western blot, e ao final, os autores encontraram 25 peptídios que poderão ser utilizados para diagnóstico ou desenvolvimento de vacinas para cães, baseados em sua reatividade com células B e T.

Mais ainda, entre as proteínas com o maior escore de imunogenicidade havia 19 proteínas com função hipotética e outras 7 com função putativa, o que agregou importantes informações para o conhecimento da função destas proteínas, já que não havia prévia descrição no que se refere a relação  hospedeiro X Leishmania.

O artigo poderá ser encontrado na íntegra aqui.

Perfil de citocinas e fenotipagem celular na leishmaniose canina

Post de Eder Fialho

No artigo de revisão “Cytokine and Phenotypic Cell Profiles of Leishmania infantum Infection in the Dog” publicado no Journal of Medicine Tropical, as autoras Carla Maia e Lenea Campino reúnem informações sobre o perfil de citocinas e a imunofenotipagem de células nos principais órgãos e tecidos acometidos na leishmaniose canina. Elas enfatizam a necessidade de caracterizar melhor os mecanismos da resposta imune para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficientes.

O paradigma Th1 e Th2 que envolve o mecanismo de resistência e susceptibilidade, respectivamente, na leishmaniose visceral canina, explica cada vez menos a resposta imune ao parasito. Isso se torna mais evidente quando se caracteriza a resposta de forma órgão-específico, onde as citocinas encontradas e a imunofenotipagem das células muitas vezes contradizem o paradigma mencionado acima, revelando que o os sistemas do hospedeiro não respondem da mesma forma.

Menezes-Sousa e colaboradores mostraram que na pele de cães naturalmente infectados, o quadro assintomático e baixo parasitismo estão associados tanto com a expressão de IFN-γ, TNF-α e IL-13 como também com o aumento da expressão de fatores de transcrição GATA-3 e FOXP-3. Da mesma forma, o estudo realizado por Strauss-Ayali e colaboradores indicou que tanto a reposta imune tipo-1 e tipo-2 ocorrem no baço de cães experimentalmente infectados. Visto isso, as autoras revisaram a resposta imune no sangue periférico, linfonodo, fígado, baço, medula óssea e pele de cães infectados com Leishmania infatum.

Essa revisão ressaltou a falibilidade dos marcadores para prognósticos na leishmaniose canina. A ideia de que a expressão de IFN-γ seria um bom marcador para cães resistentes ou assintomáticos, não foi confirmada em estudos que observaram altos níveis de expressão de IFN-γ no sangue periférico de cães sintomáticos. 

Pode-se até questionar que o sangue não é o local alvo para a replicação do parasito e por isso não refletir a evolução da doença. Entretanto, o baço, a medula óssea e o fígado, são órgãos onde se encontra uma alta carga parasitária, entretanto, expressando também altos níveis de IFN-γ, indicando que essa citocina não é um bom indicativo da eliminação do parasito.

Do ponto de vista celular, a imunofenotipagem ainda revela muitos resultados contraditórios entre os órgãos, indicando que ainda é necessária mais investigações para estabelecer o perfil celular de resistência ou susceptibilidade ao parasito.

Portanto, o artigo revela claramente a necessidade de mais investigações sobre os mecanismos da resposta imunológica montada em órgãos específicos, pois ainda existem muitos resultados contraditórios, deixando uma lacuna na definição de bons marcadores para prognóstico da leishmaniose canina.

Maia, C., & Campino, L. (2012). Cytokine and Phenotypic Cell Profiles of Leishmania infantum Infection in the Dog Journal of Tropical Medicine, 2012, 1-7 DOI: 10.1155/2012/541571

Detecção de Leishmania infantum por RT-PCR usando swab na cavidade oral e na conjuntiva de cães

Post de Rayssa Carvalho

O diagnóstico da leishmaniose visceral canina é uma tarefa complexa devido ao vasto espectro de sinais clínicos. Cães infectados podem desenvolver a doença clínica ou permanecer assintomáticos. Técnicas parasitológicas, sorológicas e moleculares são utilizadas sozinhas ou combinadas a fim de fornecer um diagnóstico preciso. 

O baço, linfonodo, medula óssea e pele são consideradas as melhores amostras na detecção do parasita por PCR, tanto em animais doentes quanto subclíncos. Entretanto, a obtenção dessas amostras é feita através de métodos invasivos, dessa forma, cresce o interesse pele uso de amostras não-invasivas na detecção de DNA de Leishmania.

Pesquisas realizadas com urina demonstraram uma baixa sensibilidade, na técnica de PCR, quando comparados à medula óssea e sangue. Em um estudo longitudinal realizado por Gramicia et al, 2010, utilizou-se DNA da mucosa conjuntival para realização do PCR, observou-se uma lenta conversão dos animais negativos para positivos, mesmo na ausência de seroconversão.

Neste estudo avaliou-se a presença de DNA de leishmania em swabs da mucosa conjuntival e oral, por PCR em tempo real, em uma população canina randomicamente selecionada numa área endêmica para a doença. Essas amostras, não-invasivas, foram comparadas com amostras de sangue e linfonodo por PCR em tempo real e com as técnicas de imunofluorescência indireta e teste de hipersensibilidade tardia (DTH).

Este estudo demonstrou pela primeira vez a presença de DNA de Leishmania em swabs da mucosa oral íntegra em cães. Os sawbs orais obtiveram uma maior percentagem de resultados positivos quando comparados com sangue, pela técnica de PCR em tempo real. Entretanto este tipo de amostra não pode ser considerado uma ferramenta sensível para o diagnostico da Leishmaniose canina, uma vez que demonstrou uma baixa sensibilidade na detecção de cães soropositivos (15%).

A carga parasitária de aspirado de linfonodo foi positivamente correlacionada com a carga encontrada em swabs da mucosa conjuntival (Pearson r=0,29;p< 0,0001). Além disso, observou-se uma correlação positiva entre os títulos de anticorpos e carga parasitária de swabs da mucosa conjuntival (Pearson r=0,27;p<0,0003), da mucosa oral (Pearson r=o,22;p<0,007) e aspirado de linfonodo (Pearson r=0,33;p<0,0001).

Uma vez que foi observado uma percentagem de positividade similar, por PCR em tempo real, nas amostras de swabs da mucosa conjuntival e do aspirado de linfonodo, sugere-se a utilização destes swabs como uma alternativa na detecção de infecção por Leishmania em cães. Esse dado é de grande importância, principalmente em estudos epidemiológicos, onde uma  quantidade grande de cães é necessária e a utilização de amostras não-invasivas tornaria o diagnóstico mais fácil e rápido.

Referencias:

Lombardo, G., Pennisi, M., Lupo, T., Migliazzo, A., Caprì, A., & Solano-Gallego, L. (2012). Detection of Leishmania infantum DNA by real-time PCR in canine oral and conjunctival swabs and comparison with other diagnostic techniques Veterinary Parasitology, 184 (1), 10-17 DOI: 10.1016/j.vetpar.2011.08.010

Maia, C., Campino, L., 2008. Methods for diagnosis of canine leishmaniasis and immune response to infection. Vet. Parasitol. 158, 274–287.

Gramiccia, M., Bettini, S., Gradoni, L., Ciarmoli, P., Verrilli, M.L., Loddo, S., Cicalo, C., 1990. Leishmaniasis in Sardinia. Leishmanin reaction in the human population of a focus of low endemicity of canine leishmaniasis. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84, 371–374.

Solano-Gallego, L., Rodriguez-Cortes, A., Trotta, M., Zampieron, C., Razia,L., Furlanello, T., Caldin, M., Roura, X., Alberola, J., 2007. Detection of Leishmania infantum DNA by fret-based real-time PCR in urine from dogs with natural clinical leishmaniosis. Vet. Parasitol. 147, 315–319.

Uso de proteínas recombinantes para diagnóstico por ELISA na leishmaniose canina

Post de Ana Paula de Almeida Souza

O diagnóstico efetivo e precoce é um passo determinante para tomada de decisões nas leishmanioses, sejam elas em seres humanos ou cães. Para isso, a detecção do parasito é tido como padrão ouro, porém, apesar da grande especificidade, nem sempre apresenta sensibilidade satisfatória. Devido a isto, os testes indiretos, baseados na resposta imune do hospedeiro são amplamente empregados. O método de ELISA utilizando antígeno bruto de Leishmania (SLA) é comumente usado para diagnosticar as leishmanioses, em especial a LV. Embora o SLA apresente alta sensibilidade, alguns antígenos parasitários apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos, além de nem sempre apresentarem reprodutibilidade dos resultados. Uma estratégia para superar estas limitações seria a busca de antígenos recombinantes de Leishmania combinando altos valores de sensibilidade e especificidade. 

Neste mês, De Souza e colaboradores [1] publicaram um trabalho que abrange a expressão, isolamento e purificação de duas proteínas recombinantes da L. chagasi, seguido da padronização do sorodiagnóstico para cães com Leishmaniose Visceral.  Para isso os autores contaram com um grande painel de 256 soros de cães provenientes do sudoeste, nordeste e centro oeste do Brasil. As proteínas descritas neste trabalho rLci 2B (homóloga a proteína do citoesqueleto) e rLci 1A (homóloga a proteína de choque térmico HSP70) foram produzidas em grande quantidade em E. coli, com rendimento em torno de 105 e 225 mg/L de cultura respectivamente. Foram obtidos altos valores de especificidade (SP) e sensibilidade (SE) nas sorologia (ELISA) para a  rLci 2B (95% e 100%) e rLci 1A (92 e 96%). As proteínas recombinantes não apresentaram reação cruzada com soro de cães infectados com Trypanosoma caninum, Babesia canis e Ehrlichia canis, entretanto foi observada reatividade contra soros obtidos de cães infectados por L. braziliensis (5,81%).

Muitas são as proteínas já descritas na literatura que apresentam elevada performance para o sorodiagnóstico da LV. Os autores chamam atenção que a maior parte destes trabalhos foram realizados a partir de pequenos painéis de soros de cães, e, além disso, estas proteínas apresentam baixo rendimento por litro de cultura.  A reação cruzada contra soro de cães com L. braziliensis deve-se provavelmente à proximidade taxonômica destes parasitos, e não compromete a eficiência das proteínas testadas, já que também é preconizado pelo Ministério da Saúde o sacrifício de cães com LC.  

Em suma, De Souza e colaboradores [1] propõem que ambas as proteínas rLci 2B e rLci 1A podem ser utilizadas como antígenos alternativos para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Visceral canina.

De Souza CM, Silva ED, Ano Bom AP, Bastos RC, Nascimento HJ, Da Silva Junior JG 2012. Evaluation of an ELISA for canine leishmaniasis immunodiagnostic using recombinant proteins. Parasite Immunol., 34(1), pp.1–7. PMID:21929686

Aula de leishmaniose com Norma Andrews

Indicação de Kiyoshi Fukutani:
"Uploaded by ibioseminars on Apr 1, 2010

In the second part of this lecture, I will present background material on Leishmania, the intracellular protozoan parasites responsible for severe human pathology in several parts of the world. I will discuss the main disease forms, the history of identification of the causative agent and form of transmission, and recent discoveries that established important concepts in our understanding of this increasingly serious infectious disease. 

See more at http://www.ibioseminars.org"

Microesferas de alginato e vacinas para a leishmaniose

Post de Diego Moura (LIP-CPqGM/FIOCRUZ)

Leishmaniose é uma doença parasitária que afeta 12 milhões de pessoas no mundo, sendo que mais de 350 milhões estão em risco de contrair a doença. A leishmaniose é causada por diferentes espécies de Leishmania, transmitida pelo flebótomo infectado. O fato de que a recuperação de uma primeira infecção confere proteção contra uma re-infecção sugere que o controle das leishmanioses através da vacinação é possível. Com o objetivo de desenvolver uma vacina eficaz contra a doença, os grupos de pesquisa fazem uso de tecnologias desde as mais simples, como por exemplo, autoclavar o parasita, até o uso de ferramentas mais avançadas como parasitas transgênicos capazes de infectar, mas não de causar a doença. O uso de parasitas autoclavados fundamenta a primeira geração de vacinas. A Leishmania major autoclavada (ALM) foi usada em testes clínicos de fase 3, apresentando uma eficácia limitada [1,2,3].

Sabe-se que a imunogenicidade de um antígeno é aumentada quando este está encapsulado em partículas biodegradáveis [4]. Desta forma, Taffaghodi e colaboradores [5] foram avaliar a capacidade protetora do ALM e CpG encapsulados em micropartículas biodegradáveis de alginato de sódio (polissacarídeo presente na parede celular de algas marinhas e algumas bactérias). Inicialmente, os autores demonstraram que o encapsulamento não afetou a integridade do antígeno, através de um gel de poliacrilamida. Depois, camundongos BALB/c foram imunizados e infectados com L. major. Os animais imunizados com ALM + CpG, (ALM)NP, (ALM)NP+CpG ou (ALM + CpG)NP apresentaram, todos eles, um menor tamanho da lesão comparado com o grupo que recebeu PBS ou somente ALM. Entretanto, é importante frisar que os animais que receberam a vacina na presença do CpG apresentaram lesões ainda menores. Já o grupo (ALM)NP que não recebeu o adjuvante, apresentou uma lesão menor do que o grupo controle, embora maior do que os grupos que receberam o CpG. Em relação à produção das citocinas analisadas, os grupos imunizados com ALM+CPG (sem partícula) e (ALM+CpG)NP apresentaram os maiores níveis de IFN-g. Em relação a IL-4, apenas o grupo imunizado com ALM+CpG apresentou uma produção maior, enquanto nos outros grupos a produção foi idêntica ou menor que os controles negativos.

Diante do acima exposto, ficou claro que apesar de obter uma proteção parcial contra a infecção por L. major, o encapsulamento do ALM e CpG em micropartículas (ALM+CpG)NP não foi capaz de melhorar o grau de proteção já obtida pela imunização com o ALM+CpG, pois nos dois grupos o grau de proteção foi o mesmo, comparando o tamanho da lesão. Fez falta neste trabalho a análise da carga parasitária, pois já se sabe que as partículas são capazes de ativar a imunidade inata. Desta forma, o grupo imunizado com (ALM+CpG)NP poderia estar apresentando uma menor carga parasitária em relação ao ALM+CpG.

1. Khalil EA, El Hassan AM, Zijlstra EE, Mukhtar MM, Ghalib HW, et al. (2000) Autoclaved Leishmania major vaccine for prevention of visceral leishmaniasis: a randomised, double-blind, BCG-controlled trial in Sudan. Lancet 356: 1565-1569.

2. Khamesipour A, Rafati S, Davoudi N, Maboudi F, Modabber F (2006) Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian J Med Res 123: 423-438.

3. Noazin S, Modabber F, Khamesipour A, Smith PG, Moulton LH, et al. (2008) First generation leishmaniasis vaccines: a review of field efficacy trials. Vaccine 26: 6759-6767.

4. Diwan M, Tafaghodi M, Samuel J (2002) Enhancement of immune responses by co-delivery of a CpG oligodeoxynucleotide and tetanus toxoid in biodegradable nanospheres. J Control Release 85: 247-262.

5. Tafaghodi M, Eskandari M, Khamesipour A, & Jaafari MR (2011). Alginate microspheres encapsulated with autoclaved Leishmania major (ALM) and CpG-ODN induced partial protection and enhanced immune response against murine model of leishmaniasis. Experimental parasitology PMID: 21767536

Trabalho do laboratório é destaque no J. Leukocyte Biology

post de Theolis Bessa

O artigo do grupo de Valéria Borges acaba de ser publicado com destaque no periódico J. of Leucocyte Biology, em "Latest News". Confira!

Sandfly saliva provides important clues for new Leishmaniasis treatments

New research published in the Journal of Leukocyte Biology suggests that salivary components from a Leishmania vector play a relevant and direct role on neutrophils, which influence parasite burden

Bethesda, MD—For millions of people who live under the constant threat of Leishmania infection, a new discovery by Brazilian scientists may lead to new breakthroughs, preventing these parasites from taking hold in the body or reducing the severity of infections once they occur. In a new report appearing in the Journal of Leukocyte Biology (http://www.jleukbio.org), scientists show that specific molecules found in the saliva of the sandfly—a small flying insect that is the vector for the parasite—make it possible for Leishmania to evade neutrophils and live within human hosts. In addition to providing a new target for drug development, this discovery may lead to new tools that help doctors more accurately gauge the severity of infections.

"Neutrophils are considered the host's first line of defense against infections and have been implicated in the immunopathogenesis of leishmaniasis, the disease caused by Leishmania," said Valeria Borges, a Brazilian researcher involved in the work. "The identification of specific key factors from neutrophils linked to human visceral leishmaniasis immunopathogenesis can lead to the description of potential biomarkers for disease severity."

To make their discovery, scientists studied how the sandfly (Lutzomyia longipalpis), an important vector of visceral leishmaniasis, affected the neutrophils of hosts. They found that the salivary components of the sandfly induced neutrophil death pathways including FasL-mediated and caspase-dependent apoptosis, and this event was associated with Leishmania survival inside these dying cells. According to the U.S. Centers for Disease Control and Prevention, cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis are caused by more than 20 different leishmanial species. Cutaneous leishmaniasis is the most common form of the disease and causes skin ulcers. Visceral leishmaniasis causes a severe systemic disease that is usually fatal without treatment. Mucocutaneous leishmaniasis is a rare but severe form affecting the nasal and oral mucosa. The disease is transmitted by the bite of sand flies, and many leishmanial species infect animals as well as humans. The distribution of the disease is world-wide, with 90 percent of cutaneous leishmaniasis cases occurring in Afghanistan, Algeria, Iran, Saudi Arabia, Syria, Brazil, Colombia, Peru, and Bolivia and 90 percent of visceral leishmaniasis cases occurring in India, Bangladesh, Nepal, Sudan, Ethiopia, and Brazil.

"We are fortunate in the United States that when most of us think of bug bites we do not have to imagine picking up a parasite that can cause open wounds or major systemic problems in our bodies," said John Wherry, Ph.D., Deputy Editor of the Journal of Leukocyte Biology. "However, for the majority of the developing world this is a substantial problem and finding ways to prevent or cure this insect transmitted diseases urgent global health priority. This research report looks beyond the parasite to see what other factors facilitate its colonization. Their discovery that the sand fly's saliva plays a critical role in the process for Leishmania should reveal new opportunities for therapeutics against this parasite."

###

The Journal of Leukocyte Biology (http://www.jleukbio.org) publishes peer-reviewed manuscripts on original investigations focusing on the cellular and molecular biology of leukocytes and on the origins, the developmental biology, biochemistry and functions of granulocytes, lymphocytes, mononuclear phagocytes and other cells involved in host defense and inflammation. The Journal of Leukocyte Biology is published by the Society for Leukocyte Biology.

Referência:

Prates, D., Araujo-Santos, T., Luz, N., Andrade, B., Franca-Costa, J., Afonso, L., Clarencio, J., Miranda, J., Bozza, P., DosReis, G., Brodskyn, C., Barral-Netto, M., de Matos Borges, V., & Barral, A. (2011). Lutzomyia longipalpis saliva drives apoptosis and enhances parasite burden in neutrophils Journal of Leukocyte Biology, 90 (3), 575-582 DOI: 10.1189/jlb.0211105

Doenças Negligenciadas: Presente e perspectivas

Minha apresentação na 63a Reunião Anual da SBPC

Platelet activation attracts a subpopulation of effector monocytes to sites of Leishmania major infection

Post de Deboraci Prates


Classicamente, os processos inflamatórios localizados envolvem a migração de leucócitos para o tecido. O pool inicial de células é constituído por neutrófilos e, em seguida, os monócitos também são recrutados para o tecido inflamatório.

Já foi descrita a existência de duas sub-populações de monócitos, baseados em suas características morfofisiológicas (1,2): células GR-1+ (Ly6C+)/ CCR2+/ CX3CR1low e células GR-1-/ CCR2-/ CX3CR1+. O artigo de Gonçalves e cols (3) traz contribuições sobre o recrutamento de monócitos em camundongos após infecção por Leishmania major.

Realizando ensaios in vivo, os autores utilizaram camundongos C57BL/6 cujo receptor CX3CR1 expressa GFP para identificar as duas maiores sub-populações de monócitos (GFPBright => CX3CR1high/GR-1- e GFPDull => CX3CR1low/GR-1-). Camundongos infectados com L. major (2x106; pata) apresentaram um maior percentual de monócitos GR-1+ no local da infecção (24 horas), enquanto que em animais não infectados as duas sub-populações de monócitos foram similares. Surpreendentemente, os autores observaram uma similaridade da cinética de recrutamento na pata e no peritônio dos animais inoculados com o parasita.

Sendo o peritônio um local propício à obtenção de um maior número de monócitos, os autores o escolheram para melhor investigar esse fenômeno. Nesse modelo fica evidente, corroborando com dados da literatura, que existe uma diferença na cinética de recrutamento celular entre diferentes linhagens de camundongos. Em BALB/c, os monócitos (população GR-1+) foram as células inicialmente recrutadas para o local de infecção (1/2 – 3 h p.i.), seguido dos neutrófilos (4 h p.i.). Já em C57BL/6 o recrutamento inicial de neutrófilos acompanhou o de monócitos (1 h p.i.), aumentando no decorrer do tempo. Curiosamente, apenas os monócitos GR-1+ estavam infectados por L.major e, após 4 horas, a maior parte dos parasitas foi morta por essas células.

Ensaios in vitro foram realizados para investigar o mecanismo de morte dos parasitas pelos monócitos. A produção de espécies reativas de oxigênio foi inicialmente avaliada utilizando a sonda H2DCFDA, observando-se uma maior produção de ROS pelos monócitos GR-1+, em resposta à infecção por L. major (60 – 180 min), quando comparado à sub-população GR-1-. Em seguida, a importância dos mecanismos oxidativos dos monócitos foi confirmada em ensaios utilizando células de camundongos gp91 (phox)-/-. Por fim, o mecanismo de migração dos monócitos induzidos pela L. major foi elegantemente investigado utilizando camundongos tratados com anti-CD41 (depleção de plaquetas) e camundongos CCR2-/-. A participação das plaquetas, através da produção de PDGF e conseqüente liberação de CCL2/MCP-1, foi associada ao recrutamento de monócitos GR-1+ no local de infecção.

Os autores discutem a relevância dos achados, principalmente no que concerne à participação das plaquetas, uma vez que estas são encontradas em grande quantidade no lago sanguíneo criado pelo vetor. Além disso, os mecanismos pelos quais os monócitos GR-1+ matam a Leishmania merecem uma investigação mais detalhada.

Referências:

1. Geissmann, F.,S. Jung, D.R. Littman. Demonstration of a specific C3a receptor on guinea pig platelets. J. Immunol. 140:3496–3501,1988.
2. Strauss-Ayali, D., S.M. Conrad, D.M. Mosser. Migrating monocytes recruited to the spleen play an important role in control of blood stage malaria. Blood. 114:5522–5531. 2009. doi:10.1182/blood-2009-04-217489.
3. Goncalves, R., Zhang, X., Cohen, H., Debrabant, A., & Mosser, D. (2011). Platelet activation attracts a subpopulation of effector monocytes to sites of Leishmania major infection Journal of Experimental Medicine, 208 (6), 1253-1265 DOI: 10.1084/jem.20101751

LRV1 e Leishmaniose mucocutânea. Será?

Post de Marcia Weber (LIP/CPqGM-FIOCRUZ)

Virus de RNA de Leishmania controla severidade da leishmaniose mucocutânea

A Leishmaniose mucocutânea, causada por parasitas do subgênero Viannia, está associada com uma resposta imune persistente com presença de mediadores pro-inflamatórios (TNF-a, CXCL10, CCL4), além de uma elevada atividade de células T citotóxicas. Ives e colaboradores, em trabalho anterior, caracterizaram clones da L. guyanensis: cepa metastática (L.g.M+) ou cepa não-metastática (L.g.M−). A partir disto, os autores sugerem que estas cepas modulam diferentemente a resposta do macrófago no hospedeiro. Neste trabalho publicado na Science este ano, utilizando técnicas de microarranjos, Ives e colaboradores identificaram expressão gênica diferenciada em macrófagos não tratados ou infectados com L.g.M+ ou L.g.M−. In vitro, os macrófagos infectados apresentaram grande quantidade de CCL5, CXCL10, TNF-a, e IL-6 após infecção com parasitas L.g.M+ quando comparados com L.g.M− ou L. major. Eles também observaram expressão aumentada nestas quimiocinas e citocinas após infecção com parasitas obtidos de lesões de pacientes com leishmaniose mucosa, comparadas com parasitas obtidos de lesões de pacientes com leishmaniose cutânea. Assim, os níveis elevados de citocinas e quimiocinas podem estar associados com parasitas que sofrem metástase. Outro aspecto importante para o parasita é que, uma vez dentro do macrófago, ele permanece dentro de um fagolisossomo. Tratar estas células com cloroquina (induz alcalinização vacuolar impossibilitando reconhecimento de PAMPs por células) ou citocalasina D (inibe fagocitose), mostra que a indução de mediadores proinflamatórios por parasitas L.g.M.+ depende da entrada do mesmo na células e seu seqüestro por fagolisossomo. Assim, eles foram avaliar o papel dos TLR. Utilizando macrófagos deficientes para TLR3, 7 ou 9, ou para MyD88 e TRIF, eles demonstram que TLR3 e TRIF são essenciais para induzir o aumento na expressão deste mediadores após infecção com L.g.M.+. Ainda, ativação de TLR7 dependente de MyD88 foi necessária para máxima secreção destes mediadores. Já se sabe que TLR3 regula positivamente também a expressão de interferons tipo I. No presente trabalho, a infecção com L.g.M.+ induz um aumento significativo de IFN-β, quando comparado com L.g.M.-. Já se sabe que parasitas do subgênero Viannia possuem o vírus de RNA (LRV1). Este vírus contem um capsídeo que protege o RNA dupla fita. Eles demonstram que L.g.M.+ possuem níveis mais elevados de LRV1 do que L.g.M.-. Eles então trataram macrófagos com LRV1 e observaram um aumento na expressão dos mesmos mediadores daqueles infectados com L.g.M.+ e este aumento também foi dependente de TLR3. Assim, o papel in vivo foi avaliado em camundongos TLR3-/-, TR7-/- e selvagens infectados. Uma diminuição significativa no tamanho da lesão e na carga parasitária foi encontrada nos camundongos TLR3-/- infectados com L.g.M.+ ou L.g.−LRV. Assim, o presente trabalho mostra que o reconhecimento de LRV1 nos parasitas L.g.M.+ pelo hospedeiro promove inflamação e subverte o sistema imune para que haja persistência do parasita. Este resultado pode facilitar o desenvolvimento de novos tratamentos para esta patologia ou até mesmo melhorar terapias já existentes.

Ives, A., Ronet, C., Prevel, F., Ruzzante, G., Fuertes-Marraco, S., Schutz, F., Zangger, H., Revaz-Breton, M., Lye, L., Hickerson, S., Beverley, S., Acha-Orbea, H., Launois, P., Fasel, N., & Masina, S. (2011). Leishmania RNA Virus Controls the Severity of Mucocutaneous Leishmaniasis Science, 331 (6018), 775-778 DOI: 10.1126/science.1199326

Vale ressaltar que este artigo foi avaliado como “must read” ou “outstanding” pelos membros da F1000.

This is a fascinating piece of work, reporting that a double-stranded (ds)RNA virus, infecting Leishmania strains of the Leishmania Viannia subgenus, contributes to the severity of mucocutaneous leishmaniasis by triggering a persistent hyperinflammatory response by the infected host.”

B. Papadopolou, Univ. of Laval, Canada

This intriguing study shows that virus infection of the protozoan parasite Leishmania influences innate immune responses in macrophages. Furthermore, the authors suggest that virally infected Leishmania excel in disseminating to nasopharyngeal tissues, causing mucocutaneous leishmaniasis.

Jan Rehwinkel and Caetano Reis e Sousa, Cancer Research, UK

Portanto, sua leitura é altamente recomendada!

Novas tecnologias para o tratamento da leishmaniose - Parte I

Post de Diego Moura-Santos (LIP/CPqGM-FIOCRUZ)

Relatos de falha clínica dos tratamentos convencionais para leishmaniose vêm aumentando gradativamente. No Estado de Bihar, Índia, já foi demonstrada uma elevada falha terapêutica com o uso de Antimonais Pentavelentes. Outras limitações ao tratamento são: elevada toxicidade, alto custo, falta de prática na administração parenteral e a necessidade de câmaras frias para armazenamento das drogas. Os custos para desenvolvimento de novas drogas são elevados e o retorno financeiro é baixo, por tratar-se de doença negligenciada. Diante do acima exposto, a busca de tratamentos alternativos como a co-administração de drogas e novas formas de “delivery” estão sendo testadas.

A terapia multidrogas melhora a eficácia dos medicamentos, reduz a dosagem, levando a uma diminuição da toxicidade e ao surgimento de parasitas resistentes. Desta forma, Seifert e colaboradores [1] avaliaram a interação in vitro do Sitamaquina com Anfotericina B, Estibogluconato de Sódio, Miltefosina, Paramomicina e Pentamidina contra a L. donovani. Eles observaram interação somente entre a Sitamaquina e a Pentamidina, que apresentaram efeito sinérgico, ou seja, seus efeitos benéficos aumentaram quando foram co-administradas. É importante salientar que este resultado não é um indicador de interação in vivo, e seria necessário avaliar a toxicidade da combinação, já que esta é uma das complicações do uso de Pentamidina como tratamento.

O encapsulamento da Anfotericina B em lipossomas diminuiu significativamente a toxicidade e melhorou a eficácia da droga no tratamento da leishmaniose, com esquema de dose única. Entretanto, o seu preço é proibitivo (US$ 18/50 mg, negociado pela OMS). Um fator que contribui para o elevado custo é o uso do colesterol (matéria-prima do lipossoma), que é purificado de fonte animal, sendo assim necessário o tratamento deste para evitar contaminações por vírus e príons. Com o objetivo de desenvolver um sistema alternativo com preço reduzido em relação aos lipossomas, Prajapati e colaboradores [2] utilizaram nanotubos de carbono. Esta nova forma de “delivery” diminuiu a toxicidade da droga comparado com a Anfotericina Lipossomal, além de ter aumentado a janela terapêutica e melhorado sua eficácia. A Anfotericina-nanotubo inibiu significativamente a replicação do parasita em hamsters comparada à Anfotericina Lipossomal (89,85% e 68,87%, respectivamente). O próximo passo deste grupo é explorar a via de administração oral, já que a falta de pratica na administração parenteral é um empecilho ao tratamento em áreas pobres. Com este mesmo objetivo, Iman e colaboradores [3] avaliaram o uso de um esterol derivado de fonte vegetal como substituto do colesterol para produção da Anfotericina lipossomal. Desta forma, 32 formulações da Anfotericina lipossomal foram desenvolvidas e comparadas com as drogas de referências – Ambisome® e Fungizone®. Das 32 formulações iniciais, os autores chegaram a uma formulação que apresentou atividade anti-fúngica e leishmanicida similar às drogas de referência e menor toxicidade aguda; entretanto, sua máxima dose tolerada foi 2,3 vezes menor comparado com a droga Ambisome® e 30 vezes maior comparada com Fungizone®. Novos estudos em modelos experimentais são necessários para avaliar o potencial terapêutico desta nova formulação in vivo, pois esta apresenta um menor custo de produção, possibilitando um menor preço final da droga.

1. Seifert K, Munday J, Syeda T, & Croft SL (2011). In vitro interactions between sitamaquine and amphotericin B, sodium stibogluconate, miltefosine, paromomycin and pentamidine against Leishmania donovani. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 66 (4), 850-4 PMID: 21393188


2. Prajapati VK, Awasthi K, Gautam S, Yadav TP, Rai M, Srivastava ON, & Sundar S (2011). Targeted killing of Leishmania donovani in vivo and in vitro with amphotericin B attached to functionalized carbon nanotubes. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 66 (4), 874-9 PMID: 21393222

3.Iman M, Huang Z, Szoka FC Jr, & Jaafari MR (2011). Characterization of the colloidal properties, in vitro antifungal activity, antileishmanial activity and toxicity in mice of a distigmasterylhemisuccinoyl-glycero-phosphocholine liposome-intercalated amphotericin B. International journal of pharmaceutics PMID: 21277963