Terapia contra micobactérias baseada no genótipo do hospedeiro

Figura adaptada de Tobin et al, 2012, Cell.

Vitor R R de Mendonça

Publicado originalmente no blog da SBI (SBlogI)

Em um estudo recentemente publicado na Cell, Tobin e cols. associaram estados pró-inflamatórios e anti-inflamatórios induzidos pelo gene LTA4H (leukotriene A4 hydrolase) e a terapia imunomoduladora na infecção por micobactéria em zebrafish e humanos. 

A primeira parte do estudo mencionado foi realizada no peixe zebrafish infectado pelo Mycobacterium marinum. Observou-se que larvas de zebrafish alteradas geneticamente com perda da função do LTA4H tinham altos níveis da lipoxina, uma molécula anti-inflamatória que aumenta a susceptibilidade à infecção pelo M. marinum através da inibição da transcrição do TNF. Baixos níveis de TNF aumentam a necrose e o crescimento bacteriano intramacrofágico. Por outro lado, larvas de zebrafish com aumento da transcrição do gene LTA4H estão associadas com maiores níveis de leucotrieno B4 (LTB4), produto da reação catalisada pela LTA4 hidrolase (vide figura acima). O aumento dos níveis da molécula pró-inflamatória LTB4 foi relacionado à elevação da concentração de TNF, que também foi associada a uma maior susceptibilidade do zebrafish à infecção pelo M. marinum por aumentar a necrose de macrófagos e o crescimento extracelular das bactérias. Portanto, tanto a alta como a baixa expressão de LTA4H estão associadas à infecção pela micobactéria, sendo por uma resposta anti-inflamatória induzida pela lipoxina ou através de uma resposta pró-inflamatória pelo LTB4, ambas tendo o TNF como molécula efetora.

A segunda parte do estudo consistiu em verificar alterações genéticas no LTA4H em humanos que possam influenciar na evolução da meningite tuberculosa (uma das formas graves da tuberculose em humanos). Verificou-se que um SNP (single nucleotide polymorphism) rs17525495 C/T na região de início de transcrição do gene LTA4H está correlacionado com níveis diferentes da sua enzima. Homozigotos mutantes (T/T) apresentaram os maiores níveis de RNAm e da proteína LTA4 hidrolase, enquanto os homozigotos selvagens (C/C), os menores níveis; tendo a condição heterozigota (C/T) níveis intermediários de LTA4H. Os autores perceberam que as alterações genéticas induzidas em larvas de zebrafish para modificar a expressão de LTA4H já existiam naturalmente em humanos. 

O próximo passo de Tobin e cols. foi verificar se este SNP poderia influenciar na evolução e terapêutica dos indivíduos com meningite tuberculosa. O uso de glucocorticóides (dexametasona) como tratamento anti-inflamatório contra a meningite tuberculosa é controverso devido a um modesto efeito benéfico evidenciado em diversos estudos. No seguimento de 182 pacientes vietnamitas com meningite tuberculosa, percebeu-se que aqueles com os genótipos T/T (alta expressão de LTA4H) e C/C (baixa expressão de LTA4H) tiveram maior mortalidade do que heterozigotos C/T. Observou-se que a terapia anti-inflamatória com dexametasona aumentou significativamente a sobrevida em indivíduos T/T e diminuiu naqueles C/C. Entretanto, os indivíduos C/C tiveram maior sobrevida enquanto aqueles T/T tiveram alta mortalidade no grupo que não usou a dexametasona (vide figura acima). Portanto, o uso da terapia anti-inflamatória seria benéfica apenas nos indivíduos T/T por terem um padrão de resposta pró-inflamatória pelo excesso de LTB4 e TNF. Nos pacientes C/C com padrão de resposta anti-inflamatória secundária a níveis elevados de lipoxina e menores concentrações de TNF, o uso de dexametasona pode inclusive aumentar a morbimortalidade.

A terapêutica baseada no genótipo do paciente é um avanço científico para entender e superar os fatores individuais relacionados à resistência ao tratamento das enfermidades. O estudo de Tobin e cols. merece atenção especial devido aos dados robustos e pioneiros, assim como pela argumentação coerente. Contudo, outros estudos em diferentes populações e com outras doenças inflamatórias serão necessários para ratificar a relevância da terapia baseada no genótipo do LTA4H proposta pelo trabalho supracitado.

Tobin DM, Roca FJ, Oh SF, McFarland R, Vickery TW, Ray JP, Ko DC, Zou Y, Bang ND, Chau TT, Vary JC, Hawn TR, Dunstan SJ, Farrar JJ, Thwaites GE, King MC, Serhan CN, & Ramakrishnan L (2012). Host genotype-specific therapies can optimize the inflammatory response to mycobacterial infections. Cell, 148 (3), 434-46 PMID: 22304914

Necroptose tem papel central no efeito letal do TNF

Post de Nívea F Luz

Na última edição de 2011 da Immunity foi publicado o artigo “RIP Kinase-Dependent Necrosis Drives Lethal Systemic Inflammatory Response Syndrome” que acrescenta bastante ao conhecimento de um importante fenômeno biológico, a necroptose. O termo necroptose é utilizado como sinônimo de necrose regulada, e na literatura denomina um caso específico de necrose que é iniciada pela ligação do TNF ao receptor 1 de TNF (TNFR1), além disso o termo necroptose pode ser usado para indicar necrose dependente de RIPK (receptor-interacting protein kinase )1 e RIPK3 (como ilustrado na figura abaixo). Esse tipo característico de necrose pode ser inibida quimicamente por Necrostatina-1 (inibidor da RIPK1) ou inibição genética da RIPK1/RIPK3 (Galluzzi et al., 2012).  

No artigo Duprez e colaboradores investigaram a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), que é uma reação inflamatória grave que afeta todo o corpo, e pode ser causada por infecções, tais como, sepse, ou por dano físico como queimaduras graves. Algo relevante sobre a SIRS é que o TNF tem um papel central na ocorrência da doença, ativando células para um perfil inflamatório e de morte celular programada. 

Inicialmente, com uma abordagem experimental de RNA de interferência em células in vitro, os autores submeteram células L929 à TNF recombinante e observaram que a necroptose induzida por TNF dependente de RIPK-1 e RIPK-3 é inibida pelo tratamento com z-VAD-fmk (um pan inibidor de caspase). Os autores silenciaram especificamente o RNA das caspase 3 e 7 (efetoras de apoptose) e caspase 8, e encontraram que apenas o silenciamento da caspase 8 implica na ocorrência de necroptose na célula. Um achado bastante interessante, uma vez que a caspase-8 é responsável pela clivagem de RIPK1 e RIPK3 e inativação dos seus efeitos “pró-necroptóticos”.  

Em seguida foi empregado um modelo experimental de SIRS, que consiste na injeção de TNF recombinante em camundongos, o que provoca uma inflamação sistêmica semelhante a SIRS e sepse. De fato a administração de TNF juntamente com z-VAD sensibiliza os camundongos ao choque induzido por TNF. Nessa etapa os autores utilizaram camundongos knockout para caspase 3, 7 e 1 (efetora da piroptose), e encontraram que essas caspases não são requeridas para a SIRS mediada por TNF. 

Os autores avançaram então para a investigação de um componente efetor da necroptose, a RIPK3 e acharam que camundongos knockout para esse gene são protegidos da SIRS induzida por TNF independente da presença ou ausência do inibidor de caspase. Além disso os autores encontraram que a proteção pela deleção da RIPK3 é acompanhada pela redução de morte celular, dano tecidual e inflamação persistente. Para investigar o papel da RIPK1 a Necrostatina foi utilizada como inibidor, uma vez que camundongos knockout para RIPK1 são inviáveis, os resultados foram semelhantes aos encontrados pela deleção de RIPK3.

Por fim, os autores utilizaram um modelo de sepse que inclui componentes microbianos, a ligação e perfuração cecal (CLP). De fato, a deleção de RIPK3 implica na proteção de camundongos da sepse ocasionada pela CLP. Esses camundongos exibiram menor liberação de padrões moleculares associados a dano (DAMP) na corrente sanguínea, e sobreviveram mais do que camundongos selvagens.  

Os achados de Duprez e colaboradores (resumidos da figura abaixo) demonstram em síntese, que em camundongos o bloqueio da necroptose confere proteção contra a SIRS letal.

Além disso, esse artigo é uma importante contribuição para a literatura por demonstrar que necroptose não é uma forma de morte celular acidental, mas que pode ocorrer de forma regulada por quinases e caspase inibidoras desse processo, dessa forma os achados reinforçam que RIPK desempenha um papel crucial na SIRS e sepse, o que pode configurar essa molécula como um alvo terapêutico para o tratamento dessas patologias.

Referências:

Duprez L, Takahashi N, Van Hauwermeiren F, Vandendriessche B, Goossens V, Vanden Berghe T, Declercq W, Libert C, Cauwels A, & Vandenabeele P (2011). RIP Kinase-Dependent Necrosis Drives Lethal Systemic Inflammatory Response Syndrome. Immunity, 35 (6), 908-18 PMID: 22195746

Galluzzi L et al, Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. v.19, n.1, 107-120. 2012.

Qual TLR induz uma resposta Th1 para antígenos amastigota-específicos?

Post de Leonardo Arruda

Um grupo de trabalho da Índia está com um paper no Mol Cell Biochem, no qual identifica quais receptores do tipo Toll (TLR) estariam sendo estimulados por frações do extrato protéico de culturas amastigostas axênicas de L. donovani. 

Para isso, os autores aplicaram o extrato protéico em gel. Após corrida, as proteínas foram divididas em quatro frações de acordo com seu peso molecular. Cada fração foi recuperada isoladamente (Fig 1A).

As frações protéicas foram utilizadas para estimular macrófagos de linhagem e analisar os seguintes parâmetros: Estresse oxidativo, produção de NO, citocinas (IL-12, TNF e IFN-γ) e expressão dos TLRs.

Baseado nos dados obtidos pela estimulação por cada fração, os autores se concentraram na fração Fa, correspondente as proteínas de maior peso molecular. Para isso, aplicaram novo gel apenas com esta fração. Logo, recuperaram frações proteínas com peso molecular mais específico. (Fig 1B)

Os autores concluem o trabalho com a descrição de que duas proteínas deste grupo, uma com 65kDa e outra com 98kDa, quando administradas concomitantemente promovem funções efetoras nos macrófagos.

O que faltou neste trabalho foi a descrição destas proteínas. Entre os métodos para esse fim, seria resolver essas proteínas em gel 2-D, e identificá-las por espectrometria de massa.

Apesar dos autores afirmarem que as duas proteínas quando administradas concomitantemente produzem ação efetora, eles não podem garantir que em sua amostra havia apenas essas duas proteínas. Todas as proteínas de pesos moleculares semelhantes também foram obtidas por esse método. O efeito efetor observado pode ser resultado de antígenos pouco abundantes na amostra. Sendo assim, a identificação destas proteínas, a obtenção de recombinantes e a prova de estimulação, com apenas estas duas proteínas purificadas seria muito mais elegante e útil.

Outro aspecto interessante que não foi abordado seria comparar a estimulação de macrófagos com o extrato protéico de promastigotas. Os autores apenas utilizaram o extrato de amastigotas axênicas, e enriqueceria mais o trabalho verificar se  as faixas protéicas analisadas nas amastigotas também também são expressas e antigênicas em promastigotas. Sendo assim, recomendo a leitura deste paper por abordar um método pouco convencional para identificar grupos de antígenos com atividade imunogênica.

Srivastava A, Singh N, Mishra M, Kumar V, Gour JK, Bajpai S, Singh S, Pandey HP, & Singh RK (2012). Identification of TLR inducing Th1-responsive Leishmania donovani amastigote-specific antigens. Molecular and cellular biochemistry, 359 (1-2), 359-68 PMID: 21858498

Variação inter-individual na resposta de células endoteliais ao efeito do TNF

O papel do TNF na patogênese da malária, em especial na forma cerebral da malária, já é conhecido há algum tempo. O TNF e o receptor de TNFTNF são biomarcadores de gravidade na malária: níveis elevados de TNF no soro são observados em pacientes de quadro clínico mais grave. O papel do TNF na gravidade se insere no quadro da tempestade de citocinas (como já foi  mostrado na malária pelo Plasmodium falciparum e mostramos recentemente para a malária causada pelo Plasmodium vivax; ref abaixo) e os efeitos já conhecidos do TNF. Este fenômeno, porém, não esclarece os aspectos mais específicos da malária cerebral, a qual é observada em apenas um subgrupo dos pacientes graves. Um artigo interessante e que pode explicar, em parte, a patogênese da malária cerebral foi publicado há pouco tempo no Cellular Microbiology: “Vascular endothelial cells cultured from patients with cerebral or uncomplicated malaria exhibit differential reactivity to TNF.” (ref abaixo).

Um etapa importante do trabalho foi demonstrar que células endoteliais da microvasculatura cerebral (obtidas de pacientes que foram ao óbito) não difere do comportamento de células obtidas do tecido celular subcutâneo, o que facilitou a investigação da resposta ex vivo das células endoteliais ao estímulo inflamatório.

Os autores então compararam células endoteliais da microvasculatura de pacientes com malária cerebral ou com malária não complicada. As céulas, em cultivo, foram expostas ao TNF e vários parâmetros foram avaliados. As células obtidas de pacientes com malária cerebral mostraram maior capacidade de modular positivamente ICAM-1, VCAM-1 e CD61 qua as células de pacientes com malária não complicada. Adicionalmente, produziram mais IL-6 e MCP-1 além de maior aumento de liberação de micropartículas e níveis celulares mais elevados de caspase-3 ativada.

As moléculas avaliadas são importantes na malária cerebral. Ocorre uma ligação específica entre ICAM-1 e as hemácias parasitadas, assim como VCAM-1 é um receptor para estas células. A CD61 está envolvida na ligação de plaquetas ativadas ao endotelio e sua regulação positiva pode estar envolvida no acúmulo de plaquetas nos vasos cerebrais. A IL-6 parece ter um duplo papel, juntamente com o TNF pode aumentar a permeabilidade endotelial - relacionado com o edema cerebral da malária, e como reguladora positiva da expressão de ICAM-1 e VCAM-1, pode aumentar a aderência leucocitária ao endotélio. Já o MCP-1 , juntamente com a regulação positiva de ICAM-1, pode estar envolvido no recrutamento e ligação de monócitos à microvasculatura cerebral.

Como explicar a diferença de resposta da célula endotelial ao estímulo do TNF? Uma possibilidade seria que a gravidade da doença influencia o paciente dos quais as células foram colhidas, ou seja que esta responsividade seria mais um efeito que uma causa. O fato das células serem cultivadas antes de estimuladas com TNF torna menos provável esta possibilidade, pois os efeitos precisariam permanecer por longo tempo (cerca de 3 semanas, com vários ciclos celulares). A outra possibilidade, adotada pelos autores, é que haja diferenças próprias dos indivíduos na responsividade das células endoteliais em relação ao estímulo inflamatório.

Embora o estudo não seja completamente conclusivo e muitas das observações feitas necessitem de comprovação em sistemas mais próximos do micro-ambiente cerebral, ele abre perspectivas interessantes. As variações individuais na capacidade de resposta da célula endotelial ao estímulo inflamatório entram no rol de possibilidades para explicar a malária cerebral.

Andrade, B., Reis-Filho, A., Souza-Neto, S., Clarêncio, J., Camargo, L., Barral, A., & Barral-Netto, M. (2010). Severe Plasmodium vivax malaria exhibits marked inflammatory imbalance Malaria Journal, 9 (1) DOI: 10.1186/1475-2875-9-13

Wassmer, S., Moxon, C., Taylor, T., Grau, G., Molyneux, M., & Craig, A. (2011). Vascular endothelial cells cultured from patients with cerebral or uncomplicated malaria exhibit differential reactivity to TNF Cellular Microbiology, 13 (2), 198-209 DOI: 10.1111/j.1462-5822.2010.01528.x