Qual TLR induz uma resposta Th1 para antígenos amastigota-específicos?

Post de Leonardo Arruda

Um grupo de trabalho da Índia está com um paper no Mol Cell Biochem, no qual identifica quais receptores do tipo Toll (TLR) estariam sendo estimulados por frações do extrato protéico de culturas amastigostas axênicas de L. donovani. 

Para isso, os autores aplicaram o extrato protéico em gel. Após corrida, as proteínas foram divididas em quatro frações de acordo com seu peso molecular. Cada fração foi recuperada isoladamente (Fig 1A).

As frações protéicas foram utilizadas para estimular macrófagos de linhagem e analisar os seguintes parâmetros: Estresse oxidativo, produção de NO, citocinas (IL-12, TNF e IFN-γ) e expressão dos TLRs.

Baseado nos dados obtidos pela estimulação por cada fração, os autores se concentraram na fração Fa, correspondente as proteínas de maior peso molecular. Para isso, aplicaram novo gel apenas com esta fração. Logo, recuperaram frações proteínas com peso molecular mais específico. (Fig 1B)

Os autores concluem o trabalho com a descrição de que duas proteínas deste grupo, uma com 65kDa e outra com 98kDa, quando administradas concomitantemente promovem funções efetoras nos macrófagos.

O que faltou neste trabalho foi a descrição destas proteínas. Entre os métodos para esse fim, seria resolver essas proteínas em gel 2-D, e identificá-las por espectrometria de massa.

Apesar dos autores afirmarem que as duas proteínas quando administradas concomitantemente produzem ação efetora, eles não podem garantir que em sua amostra havia apenas essas duas proteínas. Todas as proteínas de pesos moleculares semelhantes também foram obtidas por esse método. O efeito efetor observado pode ser resultado de antígenos pouco abundantes na amostra. Sendo assim, a identificação destas proteínas, a obtenção de recombinantes e a prova de estimulação, com apenas estas duas proteínas purificadas seria muito mais elegante e útil.

Outro aspecto interessante que não foi abordado seria comparar a estimulação de macrófagos com o extrato protéico de promastigotas. Os autores apenas utilizaram o extrato de amastigotas axênicas, e enriqueceria mais o trabalho verificar se  as faixas protéicas analisadas nas amastigotas também também são expressas e antigênicas em promastigotas. Sendo assim, recomendo a leitura deste paper por abordar um método pouco convencional para identificar grupos de antígenos com atividade imunogênica.

Srivastava A, Singh N, Mishra M, Kumar V, Gour JK, Bajpai S, Singh S, Pandey HP, & Singh RK (2012). Identification of TLR inducing Th1-responsive Leishmania donovani amastigote-specific antigens. Molecular and cellular biochemistry, 359 (1-2), 359-68 PMID: 21858498

IL-32γ Induz Maturação de Células Dendriticas com Capacidade de Polarização Th1 e Th17 através da Produção Aumentada de IL-12 e IL-6

Post de Natalia Machado

As células dendriticas (DCs) atuam nos tecidos como sentinelas. Após sinal de perigo/maturação, estas células sofrem maturação e migram para os órgãos linfoides secundários, onde apresentam antígeno e estimulam células T. Maturação e ativação das DCs tem papel central entre resposta imune inata e adaptativa. Porém, o papel da IL-32 nestes processos e na sua capacidade em polarizar células T CD4 não é claro.

Inicialmente os autores trataram DCs derivadas da medula óssea com IL-32γ e observaram, por FACS, um aumento dose-dependente de MHC-II, CD86 e CD40. Além disso, a expressão de genes relacionados à maturação de DCs foi avaliada por RT-PCR. A expressão gênica de IL-6, IL-1β e TNF-α estavam significativamente aumentadas, enquanto a de TGF-β não foi alterada. A expressão de IL-12, IL-23 e IL-27 também estavam aumentadas na presença de IL-32γ de modo dose-dependente. Resultados similares foram obtidos por ELISA, com exceção da IL-10 que também foi induzida na presença de IL-32. Para confirmar funcionalmente a indução de maturação, a capacidade endocitica das DCs foi avaliada. Os resultados mostram que o percentual de DCs dextran-FITC positivas é menor naquelas tratadas com IL-32, indicando que houve indução de maturação funcional destas células.

Para esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na maturação e ativação das DCs, as células foram tratadas com inibidores de cinases sinalizadoras e NF-κB antes da incubação com IL-32γ. A produção de IL-12 e IL-6 foram significativamente reduzidas com inibidores de PLC, JNK e NF-κB. No entanto, a inibição de p38 também inibiu a produção de IL-6, indicando que outras vias podem regular sua produção.

Em seguida, os autores avaliaram se IL-32γ induz maturação de DCs em APC funcionais. Para isso, células T CD4+ foram isoladas de camundongos BALB/c (I-Ad) e cultivadas com DCs de C57BL/6 (I-Ab) tratadas com IL-32γ. Os resultados mostram que DCs tratadas com IL-32γ estimularam resposta proliferativa mais eficientemente do que células controles não tratadas e em níveis similares às DCs tratadas com LPS. Além disso, o tratamento de DCs com IL-32γ aumentou de modo significativo o percentual de células T CD4+ expressando IL-2. A produção de IFN-γ, bem como o percentual de células produzindo IFN-γ, também estavam aumentados nas co-culturas com DCs tratadas com IL-32γ. Nestas culturas, foram observadas expansão e ativação de células Th17. A produção de IL-4 não foi alterada. Com a neutralização de IL-12p40 por anticorpo, a produção de IFN-γ foi significativamente reduzida.





Para confirmar se IL-6, IL-1β, IL-21 e IL-23 derivadas de DCs tratadas com IL-32γ estavam envolvidas na diferenciação de células Th17, os autores usaram anticorpos neutralizantes específicos para cada citocina. O bloqueio de IL-1β ou IL-6 reduziu a produção de IL-17 por células T CD4+ co-cultivadas. A neutralização de IL-21 ou IL-23 não teve efeito.

Por fim, os autores transferiram DCs tratadas com IL-32γ para camundongos sensibilizados com OVA. Os resultados mostram que a injeção de DCs aumenta a produção de IFN-γ e IL-17, mas não de IL-4. As populações Th1 e Th17 estavam aumentadas nos animais que receberam as DCs tratadas. Os resultados obtidos neste estudo mostram que DCs estimuladas com IL-32γ podem modular a polarização Th1 e Th17 tanto in vitro quanto in vivo.

O grupo conclui que IL-32γ parece funcionar como mediador de maturação e ativação de DCs, resultando na produção aumentada de IL-12 e IL-6, citocinas polarizadoras Th1 e Th17, via PLV/JNK/NF-κB. Estes resultados podem explicar o papel da IL-32 na resposta imune inata e adaptativa que pode ser relevante para a patogênese de doenças inflamatórias.

Referência:

Jung MY, Son MH, Kim SH, Cho D, & Kim TS (2011). IL-32gamma Induces the Maturation of Dendritic Cells with Th1- and Th17-Polarizing Ability through Enhanced IL-12 and IL-6 Production. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) PMID: 21551364

Defesa de Mestrado de Elisabete Lopes Conceição

Título: Estudo do polimorfismo dos genes das citocinas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-1β e dos receptores tipo Toll 2 e 4 em voluntários sadios revacinados com BCG

Elisabete defendeu ontem sua dissertação na Pós-graduação em Imunologia (PPgIM) do Instituto de Ciências da Saúde – UFBa, tendo como banca examinadora a Dra. Martha Maria de Oliveira do Centro de Pesquisas em Tuberculose da Faculdade de Medicina – Hospital universitário Clementino Fraga Filho, UFRJ, a Dra. Deni se Lemaire, do PPgIM e Universidade Estadual da Bahia, além de sua orientadora, a Dra. Theolis Costa Barbosa Bessa. 

Em seu trabalho, a aluna mostra a caracterização genotípica de indivíduos revacinados com BCG, procurando verificar se os polimorfismos estudados em genes de citocinas e receptores do tipo Toll podem explicar a variabilidade da produção de IFN-γ antes e após a revacinação de voluntários saudáveis e sem infecção tuberculosa latente.

A produção de citocinas afeta amplamente as células do linfonodo

Post de Diego Moura.

A visão corrente é que as citocinas têm um efeito limitado ao microambiente no qual são produzidas.  Neste mês de junho, o grupo de Markus Mohrs publicou na Nature Immunology um excelente trabalho, contestando a idéia de que a ação das citocinas no linfonodo é restrita a algumas áreas, afetando somente as células próximas à fonte produtora (Sustained signaling by canonical helper T cell cytokines throughout the reactive lymph node. Nature Immunology 11, 520–526 (2010) doi:10.1038/ni.1866).

Os autores mostraram que durante a infecção, as citocinas IL-4 e IFN-g, marcadores da resposta Th2 e Th1 respectivamente, afetam todas as células presentes no linfonodo drenante. Na infecção por helminto, ocorre a fosforilação do STAT6 nas diferentes populações celulares (células B, CD4+ e CD8+), e aumento na expressão do receptor de IL-4 (IL4r). De forma análoga, a infecção por protozoários leva à fosforilação do STAT-1 nas diferentes populações celulares, e conseqüente aumento na expressão de MHC-I.

Outro ponto interessante discutido no trabalho é a “promiscuidade” da citocina IL-4. Diferente do IFN-g, a presença da IL-4 altera a resposta de células “naive” e “bystander”, induzindo estas para um perfil Th2 sem a necessidade de seus TCRs (receptor de células T) reconhecerem o antígeno.

Para finalizar, foi mostrado que durante a infecção por helminto, a produção de IL-4 no linfonodo drenante impede o desenvolvimento de resposta Th1 após imunização dos animais com células dendríticas pulsadas com Yersinia pestis. Desta forma, a infecção por helmintos pode ser um problema para o desenvolvimento de vacinas, pois é estimado que 1 bilhão de pessoas estejam contaminadas cronicamente por estes parasitas.

Eles concluem:

"Our results demonstrate that despite localized production, cytokines can permeate a lymph node and modify the majority of cells therein. Cytokine conditioning of bystander cells could provide a mechanism by which chronic worm infections subvert the host response to subsequent infections or vaccination attempts."