Variações genéticas de TLR-4, TLR-9 e TIRAP em pacientes com malária

TLR e TIRAP na mediação da transcrição de citocinas inflamatórias. 

Por Lígia Correia Lima de Souza

A malária está entre as três principais doenças infecciosas do planeta, no ano de 2010 a incidência foi cerca de 216 milhões de casos e 655.000 mortes. Os casos de malária grave cursam tipicamente com anemia, acidose metabólica, hipóxia, hipoglicemia, acidose lática, hipotensão e por vezes com malária cerebral. Nessa gama de manifestações, mediadores inflamatórios são de ampla importância na manifestação da doença grave. Para deflagrar a produção desses mediadores inflamatórios os TLRs (Toll-like receptors) desempenham um papel importante(ver figura).

Através do reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), os TLRs promovem não somente a produção de citocinas inflamatórias, como também, a migração e maturação de células dendríticas, facilitando a comunicação entre a imunidade inata e a adquirida. A via mediada pelo TLR com produção de citocinas inflamatórias pode ser intensificada ou atenuada por polimorfismos genéticos nesses receptores ou em moléculas associadas. Em humanos TLR2, TLR4 e TLR9 estão envolvidos na resposta contra o plasmódio. Neste sentido, Zakeri et al  (2011) investigou SNPs (Single nucleotide polymorphims) nos genes de TLR4, TLR9 e de TIRAP (uma proteína adaptadora associada com TLR) e os relacionou com o desfecho da infecção por malária leve em uma população iraniana. 

Para isso, estudou-se 640 indivíduos - 320 saudáveis e 320 com malária sintomática. Foram feitos testes de PCR para constatar a infecção por Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum ou coinfecção. Através de PCR seguido por corte com enzima de restrição (método RFLP – restriction fragment lenght polymorphim) e leitura em eletroforese com gel de agarose, bem como por meio de sequenciamento dos genes referidos, os seguintes polimorfismos foram analisados:

• No gene de TLR4 investigou-se D299G e T399I (SNPs que alteram o sítio de ligação do TLR e são correlacionados com malária grave)
• Na região promotora de TLR9 investigou T-1486C e T-1237C (associados com asma e malária placentária respectivamente)
• No gene de TIRAP o SNP S180L foi estudado (relacionado à redução da sinalização de TLR2 e TLR4, e a heterozigose é relacionada à proteção em malária grave e a uma resposta inflamatória moderada).

Entre os indivíduos infectados todos apresentaram monoinfecção por P. falciparum com malária leve. Após a análise dos polimorfismos descritos, não foi encontrada associação entre a distribuição dos alelos dos polimorfismos pesquisados e manifestações clínicas. Em seguida, analisou-se a frequência genotípica, não sendo encontrada associação entre os SNPs de TLR4, ou de TLR9 e as manifestações clínicas de malária leve.  Por outro lado, heterozigose do SNP S180L do gene TIRAP foi mais frequente entre os indivíduos infectados que entre os não infectados (33.8 vs. 25.6; OR, 1.479; 95% CI, 1.051-2.081; P = 0.024).

Em diálogo com outros trabalhos, o estudo de Zakeri et al (2011), ao demonstrar níveis maiores de heterozigose de SNP S180L do gene TIRAP em indivíduos com malária leve, pode ratificar os trabalhos anteriores que associam o papel do SNP S180L com a proteção contra malária grave. Os heterozigotos para esse polimorfismo têm níveis intermediários de ativação das vias de TLR2 e TLR4, apresentando, portanto, uma resposta inflamatória moderada e protetora (com malária leve).

Por fim, entender a relação entre os polimorfismos e a gravidade, suscetibilidade ou resistência à malária é um grande avanço para a elaboração de estratégias terapêuticas e identificação de alvos para vacinas. Contudo, outros estudos em distintas populações são necessários para confirmar a relevância de tais variabilidades genéticas no desfecho clínico da malária e de outras doenças infecciosas.

Sedigheh Zakeri, Sakineh Pirahmadi, Akram A Mehrizi, & Navid D Djadid (2011). Genetic variation of TLR-4, TLR-9 and TIRAP genes in Iranian malaria patients Malaria Journal , 10 DOI: 10.1186/1475-2875-10-77

STEVENSON, M.M., RILEY E.M. Innate Immunity to Malaria. Nature Reviews, Immunology, March 2004 | Volume 4.

WHO, 10 facts on malária disponível em: http://www.who.int/features/factfiles/malaria/en/index .html, acesso em: 01 de set. 2012.

Qual TLR induz uma resposta Th1 para antígenos amastigota-específicos?

Post de Leonardo Arruda

Um grupo de trabalho da Índia está com um paper no Mol Cell Biochem, no qual identifica quais receptores do tipo Toll (TLR) estariam sendo estimulados por frações do extrato protéico de culturas amastigostas axênicas de L. donovani. 

Para isso, os autores aplicaram o extrato protéico em gel. Após corrida, as proteínas foram divididas em quatro frações de acordo com seu peso molecular. Cada fração foi recuperada isoladamente (Fig 1A).

As frações protéicas foram utilizadas para estimular macrófagos de linhagem e analisar os seguintes parâmetros: Estresse oxidativo, produção de NO, citocinas (IL-12, TNF e IFN-γ) e expressão dos TLRs.

Baseado nos dados obtidos pela estimulação por cada fração, os autores se concentraram na fração Fa, correspondente as proteínas de maior peso molecular. Para isso, aplicaram novo gel apenas com esta fração. Logo, recuperaram frações proteínas com peso molecular mais específico. (Fig 1B)

Os autores concluem o trabalho com a descrição de que duas proteínas deste grupo, uma com 65kDa e outra com 98kDa, quando administradas concomitantemente promovem funções efetoras nos macrófagos.

O que faltou neste trabalho foi a descrição destas proteínas. Entre os métodos para esse fim, seria resolver essas proteínas em gel 2-D, e identificá-las por espectrometria de massa.

Apesar dos autores afirmarem que as duas proteínas quando administradas concomitantemente produzem ação efetora, eles não podem garantir que em sua amostra havia apenas essas duas proteínas. Todas as proteínas de pesos moleculares semelhantes também foram obtidas por esse método. O efeito efetor observado pode ser resultado de antígenos pouco abundantes na amostra. Sendo assim, a identificação destas proteínas, a obtenção de recombinantes e a prova de estimulação, com apenas estas duas proteínas purificadas seria muito mais elegante e útil.

Outro aspecto interessante que não foi abordado seria comparar a estimulação de macrófagos com o extrato protéico de promastigotas. Os autores apenas utilizaram o extrato de amastigotas axênicas, e enriqueceria mais o trabalho verificar se  as faixas protéicas analisadas nas amastigotas também também são expressas e antigênicas em promastigotas. Sendo assim, recomendo a leitura deste paper por abordar um método pouco convencional para identificar grupos de antígenos com atividade imunogênica.

Srivastava A, Singh N, Mishra M, Kumar V, Gour JK, Bajpai S, Singh S, Pandey HP, & Singh RK (2012). Identification of TLR inducing Th1-responsive Leishmania donovani amastigote-specific antigens. Molecular and cellular biochemistry, 359 (1-2), 359-68 PMID: 21858498

Antimaláricos recomendados para pacientes com lupus (pelo efeito anti-inflamatório)

Um estudo publicado no Arthritis and Rheumatology (janeiro 2010) mostra que o uso de antimaláricos é benéfico para pacientes com lupus eritematoso sistêmico (LES), baseado nos dados de uma corte multi-nacional latino-americana.  O estudo ("Antimalarials may have a time-dependent effect in lupus survival: Data from the multinational latin American inception GLADEL cohort") inclui pacientes do Brasil, Argentina, Colombia, Venezuela, México e Chile.

Tendo uma mediana de tempo de observação (follow-up) de 55 meses, o grupo de pacientes com uso de anti-maláricos  teve uma taxa de mortalidade de 4,4% enquanto nos demais pacientes foi de 11,5 (p<0,001).

Há bastante tempo se usa antimaláricos no tratamento do lupus. Medicamentos anti-malária como chloroquine, hydroxychloroquine e quinacrine (derivados da casca da árvore quina peruana) também são drogas anti-reumáticas.  Osnti-maláricos foram utilizados pela primeira vez durante a Segunda Guerra Mundial para tratar infecções parasitárias como a malária. Na década de 1960 verificou-se que estes medicamentos podem também ser utilizados para tratar a dor articular que ocorre com artrite reumatóide. Logo depois, começou o seu uso no tratamento de dores articulares associadas com lúpus.

Há muito tempo foi descrita a capacidade da hidroxicloroquina de aumentar o pH lisossomal em células apresentadoras de antígenos, o mecanismo de ação anti-inflamatório não estava completamente esclarecido.  Mais recentemente foi descrito que a hidroxicloroquina bloqueia a ativação de toll-like receptors (TLR) em células dendrítiticas plasmocitóides. O TLR 9, que reconhece imuno-complexos contendo DNA, leva à produção de interferon e à maturação de células dendríticas, o que resulta em apresentação de antígeno aos linfócitos T. A hidroxicloroquina, ao diminuir a sinalização pelo TLR reduz a ativação de células dendríticas e, assim, reduz o processo inflamatório.

Shinjo, S., Bonfá, E., Wojdyla, D., Borba, E., Ramirez, L., Scherbarth, H., Tavares Brenol, J., Chacón-Diaz, R., Neira, O., Berbotto, G., De La Torre, I., Acevedo-Vázquez, E., Massardo, L., Barile-Fabris, L., Caeiro, F., Silveira, L., Sato, E., Buliubasich, S., Alarcón, G., & Pons-Estel, B. (2010). Antimalarials may have a time-dependent effect in lupus survival: Data from the multinational latin American inception GLADEL cohort Arthritis & Rheumatism DOI: 10.1002/art.27300