Proteomica para escolha de novos antígenos para vacina e diagnóstico na leishmaniose

Legenda: Superior esquerdo – extrato de promastigotas (Verde)

Superior direito – Amastigotas (Vermelho)

Inferior esquerdo – Padrão / Controle

Inferior direito – Sobreposição de amastigotas e promastigotas (amarelo para sobreposições)

Post de Leonardo Arruda

Com objetivo de identificar novos antígenos, foi publicadono ano passado um trabalho (Analysis of Leishmania chagasi by 2-D Difference Gel Eletrophoresis (2-D DIGE) and Immunoproteomic: Identification of Novel Candidate Antigens for Diagnostic Tests and Vaccine; DOI: 10.1021/pr101286y) que comparou o perfil proteômico de Leishmania chagasi entre proteínas de amastigotas contra promastigotas.

Para isso, os autores utilizaram uma combinação de poderosas ferramentas, como DIGE-2D, Western Blot 2D e MaldiTof, seguidas por uma análise através de softwares. 

Foram visualizados 900 spots, entre amastigotas e promastigotas (figura 1 DIGE-2D). Dentre eles, foram retirados 113 spots para identificação da proteína por Maldi-Tof. Cinco proteínas foram especificamente identificadas como pertencentes a fase amastigota, 25 únicas para a fase promastigota e 10 proteínas identificadas como presentes tanto nas fases amastigota quanto promastigota. Além disso, 41 proteínas foram identificadas usando soro de cães infectados por Western blot 2D, que entre elas, 3 foram reativas a IgM e 38 reativas a IgG total. Os autores também mapearam os epítopos para células B utilizando um arranjo de peptídios com soro de cães. O mapeamento de 180 epítopos para células T CD8+ foi realizado in silico para todas as proteínas reconhecidas por Western blot, e ao final, os autores encontraram 25 peptídios que poderão ser utilizados para diagnóstico ou desenvolvimento de vacinas para cães, baseados em sua reatividade com células B e T.

Mais ainda, entre as proteínas com o maior escore de imunogenicidade havia 19 proteínas com função hipotética e outras 7 com função putativa, o que agregou importantes informações para o conhecimento da função destas proteínas, já que não havia prévia descrição no que se refere a relação  hospedeiro X Leishmania.

O artigo poderá ser encontrado na íntegra aqui.

Detecção de Leishmania infantum por RT-PCR usando swab na cavidade oral e na conjuntiva de cães

Post de Rayssa Carvalho

O diagnóstico da leishmaniose visceral canina é uma tarefa complexa devido ao vasto espectro de sinais clínicos. Cães infectados podem desenvolver a doença clínica ou permanecer assintomáticos. Técnicas parasitológicas, sorológicas e moleculares são utilizadas sozinhas ou combinadas a fim de fornecer um diagnóstico preciso. 

O baço, linfonodo, medula óssea e pele são consideradas as melhores amostras na detecção do parasita por PCR, tanto em animais doentes quanto subclíncos. Entretanto, a obtenção dessas amostras é feita através de métodos invasivos, dessa forma, cresce o interesse pele uso de amostras não-invasivas na detecção de DNA de Leishmania.

Pesquisas realizadas com urina demonstraram uma baixa sensibilidade, na técnica de PCR, quando comparados à medula óssea e sangue. Em um estudo longitudinal realizado por Gramicia et al, 2010, utilizou-se DNA da mucosa conjuntival para realização do PCR, observou-se uma lenta conversão dos animais negativos para positivos, mesmo na ausência de seroconversão.

Neste estudo avaliou-se a presença de DNA de leishmania em swabs da mucosa conjuntival e oral, por PCR em tempo real, em uma população canina randomicamente selecionada numa área endêmica para a doença. Essas amostras, não-invasivas, foram comparadas com amostras de sangue e linfonodo por PCR em tempo real e com as técnicas de imunofluorescência indireta e teste de hipersensibilidade tardia (DTH).

Este estudo demonstrou pela primeira vez a presença de DNA de Leishmania em swabs da mucosa oral íntegra em cães. Os sawbs orais obtiveram uma maior percentagem de resultados positivos quando comparados com sangue, pela técnica de PCR em tempo real. Entretanto este tipo de amostra não pode ser considerado uma ferramenta sensível para o diagnostico da Leishmaniose canina, uma vez que demonstrou uma baixa sensibilidade na detecção de cães soropositivos (15%).

A carga parasitária de aspirado de linfonodo foi positivamente correlacionada com a carga encontrada em swabs da mucosa conjuntival (Pearson r=0,29;p< 0,0001). Além disso, observou-se uma correlação positiva entre os títulos de anticorpos e carga parasitária de swabs da mucosa conjuntival (Pearson r=0,27;p<0,0003), da mucosa oral (Pearson r=o,22;p<0,007) e aspirado de linfonodo (Pearson r=0,33;p<0,0001).

Uma vez que foi observado uma percentagem de positividade similar, por PCR em tempo real, nas amostras de swabs da mucosa conjuntival e do aspirado de linfonodo, sugere-se a utilização destes swabs como uma alternativa na detecção de infecção por Leishmania em cães. Esse dado é de grande importância, principalmente em estudos epidemiológicos, onde uma  quantidade grande de cães é necessária e a utilização de amostras não-invasivas tornaria o diagnóstico mais fácil e rápido.

Referencias:

Lombardo, G., Pennisi, M., Lupo, T., Migliazzo, A., Caprì, A., & Solano-Gallego, L. (2012). Detection of Leishmania infantum DNA by real-time PCR in canine oral and conjunctival swabs and comparison with other diagnostic techniques Veterinary Parasitology, 184 (1), 10-17 DOI: 10.1016/j.vetpar.2011.08.010

Maia, C., Campino, L., 2008. Methods for diagnosis of canine leishmaniasis and immune response to infection. Vet. Parasitol. 158, 274–287.

Gramiccia, M., Bettini, S., Gradoni, L., Ciarmoli, P., Verrilli, M.L., Loddo, S., Cicalo, C., 1990. Leishmaniasis in Sardinia. Leishmanin reaction in the human population of a focus of low endemicity of canine leishmaniasis. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84, 371–374.

Solano-Gallego, L., Rodriguez-Cortes, A., Trotta, M., Zampieron, C., Razia,L., Furlanello, T., Caldin, M., Roura, X., Alberola, J., 2007. Detection of Leishmania infantum DNA by fret-based real-time PCR in urine from dogs with natural clinical leishmaniosis. Vet. Parasitol. 147, 315–319.

Uso de proteínas recombinantes para diagnóstico por ELISA na leishmaniose canina

Post de Ana Paula de Almeida Souza

O diagnóstico efetivo e precoce é um passo determinante para tomada de decisões nas leishmanioses, sejam elas em seres humanos ou cães. Para isso, a detecção do parasito é tido como padrão ouro, porém, apesar da grande especificidade, nem sempre apresenta sensibilidade satisfatória. Devido a isto, os testes indiretos, baseados na resposta imune do hospedeiro são amplamente empregados. O método de ELISA utilizando antígeno bruto de Leishmania (SLA) é comumente usado para diagnosticar as leishmanioses, em especial a LV. Embora o SLA apresente alta sensibilidade, alguns antígenos parasitários apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos, além de nem sempre apresentarem reprodutibilidade dos resultados. Uma estratégia para superar estas limitações seria a busca de antígenos recombinantes de Leishmania combinando altos valores de sensibilidade e especificidade. 

Neste mês, De Souza e colaboradores [1] publicaram um trabalho que abrange a expressão, isolamento e purificação de duas proteínas recombinantes da L. chagasi, seguido da padronização do sorodiagnóstico para cães com Leishmaniose Visceral.  Para isso os autores contaram com um grande painel de 256 soros de cães provenientes do sudoeste, nordeste e centro oeste do Brasil. As proteínas descritas neste trabalho rLci 2B (homóloga a proteína do citoesqueleto) e rLci 1A (homóloga a proteína de choque térmico HSP70) foram produzidas em grande quantidade em E. coli, com rendimento em torno de 105 e 225 mg/L de cultura respectivamente. Foram obtidos altos valores de especificidade (SP) e sensibilidade (SE) nas sorologia (ELISA) para a  rLci 2B (95% e 100%) e rLci 1A (92 e 96%). As proteínas recombinantes não apresentaram reação cruzada com soro de cães infectados com Trypanosoma caninum, Babesia canis e Ehrlichia canis, entretanto foi observada reatividade contra soros obtidos de cães infectados por L. braziliensis (5,81%).

Muitas são as proteínas já descritas na literatura que apresentam elevada performance para o sorodiagnóstico da LV. Os autores chamam atenção que a maior parte destes trabalhos foram realizados a partir de pequenos painéis de soros de cães, e, além disso, estas proteínas apresentam baixo rendimento por litro de cultura.  A reação cruzada contra soro de cães com L. braziliensis deve-se provavelmente à proximidade taxonômica destes parasitos, e não compromete a eficiência das proteínas testadas, já que também é preconizado pelo Ministério da Saúde o sacrifício de cães com LC.  

Em suma, De Souza e colaboradores [1] propõem que ambas as proteínas rLci 2B e rLci 1A podem ser utilizadas como antígenos alternativos para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Visceral canina.

De Souza CM, Silva ED, Ano Bom AP, Bastos RC, Nascimento HJ, Da Silva Junior JG 2012. Evaluation of an ELISA for canine leishmaniasis immunodiagnostic using recombinant proteins. Parasite Immunol., 34(1), pp.1–7. PMID:21929686

Valor preditivo de testes baseados na liberação de IFN-gama para a ocorrência de tuberculose ativa

Fonte: Corpo Saun

Post de Theolis Bessa

A tuberculose segue como um importante problema de saúde pública em todo o mundo. Os índices da doença vêm caindo, sobretudo pelo investimento no diagnóstico precoce e terapia supervisionada. Porém, com um terço da população mundial infectada pelo bacilo, tem-se investido na pesquisa de métodos diagnóstico e biomarcadores que possam prever a transição da doença latente para a doença ativa, como estratégia para restringir o contágio de novos hospedeiros.

Nesta revisão sistemática e meta-análise, o grupo de Madhkar Pai se debruça na análise dos novos ensaios de liberação de IFN-gama (IGRAs), que vêm sendo testados em várias populações como potencial substituto para o teste tuberculínico intradérmico (que utiliza o derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosis , o PPD) no diagnóstico da tuberculose latente. Os IGRAs apresentam maior especificidade para a detecção da infecção tuberculosa pois utilizam antígenos que estão presentes em um número restrito de micobactérias do complexo M. tuberculosis, o que assegura que reações ao teste não sejam influenciadas por contato com outras micobactérias ambientais ou pela vacinação prévia com a BCG. No entanto, ambos os testes são incapazes de distinguir pacientes com tuberculose latente de pacientes com tuberculose ativa.

Os IGRAs são testes relativamente novos, e não há consenso sobre se indivíduos com IGRA positivo seriam elegíveis para a quimioprofilaxia, à semelhança do que tem sido estabelecido para comunicantes de pacientes com tuberculose ativa que apresentaram conversão ao teste tuberculínico. Neste estudo, não se observa risco aumentado de desenvolvimento da doença ativa em indivíduos com teste IGRA positivo em comparação com indivíduos com teste tuberculínico positivo, em um seguimento médio de 2 a 6 anos. O risco relativo estimado no estudo de desenvolvimento de tuberculose entre indivíduos diagnosticados com tuberculose latente é de aproximadamente duas vazes superior ao encontrado entre indivíduos sem diagnóstico de tuberculose latente, para ambos os testes. É importante salientar que a análise buscou incluir tanto estudos realizados em países com elevada renda (“desenvolvidos”), e baixa incidência da doença, como países com média e baixa renda (“em desenvolvimento”). Devido às características dos estudos incluídos na análise, entretanto, após a exclusão de estudos com potencial confundimento não foi possível verificar se há influência desta divisão em relação à renda na acurácia da previsão da progressão da doença latente para a doença ativa.

Os IGRAs constituem um primeiro avanço na busca de melhores testes diagnóstico para a tuberculose, que possam auxiliar melhor no controle da doença. Será necessário continuar investindo na busca de biomarcadores que possam orientar a quimioprofilaxia de indivíduos com a tuberculose latente, de forma a utilizar esta estratégia racionalmente, já que as drogas anti-tuberculosas apresentam efeitos colaterais importantes e deve-se equacionar os potenciais benefícios e riscos de implementação desta terapia.

Referências:

Rangaka, M., Wilkinson, K., Glynn, J., Ling, D., Menzies, D., Mwansa-Kambafwile, J., Fielding, K., Wilkinson, R., & Pai, M. (2011). Predictive value of interferon-γ release assays for incident active tuberculosis: a systematic review and meta-analysis The Lancet Infectious Diseases DOI: 10.1016/S1473-3099(11)70210-9