Detecção molecular de Leishmania

Post de Kiyoshi F. Fukutani

Seguem abaixo dois comentários sobre artigos de detecção de leishmania por PCR em tempo real. O primeiro deles foi publicado em marco deste ano, com o título de Molecular diagnosis of Old World Leishmaniasis: Real-time PCR based on tryparedoxin peroxidase gene for the detection and identification of Leishmania spp. Escrito Sharifeh Khosravi e colaboradores, todos provenientes do Irã, e é incrível como o Irã tem aparecido cada vez mais nos periódicos científicos. Segundo a revista Galileu (revista de circulação aberta e popular no brasil). “Qual país teve um "boom" de produção científica entre 1996 e 2008, saltando de 736 artigos publicados para 13.238? A resposta - o Irã - pode surpreender muitas pessoas, especialmente nos países ocidentais acostumados a liderar a maioria das pesquisas científicas. O Irã, no entanto, tem a maior taxa de crescimento na publicação de artigos científicos no mundo”...“E se as relações políticas entre o Irã e os EUA estão tensas, parece que os cientistas dos dois países estão se relacionando sem problemas: o número de trabalhos colaborativos entre eles aumentou quase cinco vezes (de 388 para 1831) no período estudado”... “A rápida ascensão do Oriente Médio, da China, da Índia e do Brasil no campo da ciência se destaca em um relatório publicado nesta semana pela Royal Society do Reino Unido, comparando a publicação global e as taxas de citações entre 1993 e 2003 com as taxas de citação entre 2004 e 2008”. Leia aqui.

Neste artigo cientifico é confirmada mais uma vez pelos autores a alta sensibilidade das técnicas moleculares em se identificar a presença do parasito. Porém, o diferencial deste trabalho é o alvo escolhido, que é o tryparedoxin peroxidase uma enzima presente nos tripanossomátideos que os protegem contra o stress oxidativo (aqui). Este gene está presente na Leishmania major em três cópias, em tandem no cromossomo 15 (Multicopy gene in tandem array, expressed in all life cycle stages (PMID:9632596), (PMID:9851612); Preferentially oxidise the sulphydrl groups on conserved cysteine residues (PMID:8386507). O ponto alto do texto é a adição de mais um gene a grande lista de possíveis marcadores para se detectar a Leishmania spp.

O outro artigo é de Weirather, do grupo da Mary E. Wilson: Serial Quantitative PCR Assay for detection, species discrimination, and quantification of Leishmania spp. in Human Samples. Publicado na Journal of clinical microbiology. Nov. 2011. Este artigo é muito denso e completo, selecionado por mim como um trabalho de cabeceira para implementação de técnicas de PCR para detecção do parasito. Inicialmente os autores descrevem os genes mais utilizados para detecção de Leishmania por PCR em tempo real, “visitando toda a vizinhança” do kDNA (tanto o mini como o max círculos) a polimerase. O texto também explica a variação da sensibilidade das reações a depender do número de cópias do alvo e os autores padronizam uma corrida com o SYBR e com  sondas Taqman para identificação das espécies de Leishmania através da análise da curva de dissociação.

Um ponto importante do artigo é o teste das amostras, mostrando que a metodologia aplicada é sensível o suficiente para trabalhar com as amostra dos pacientes de área endêmica e o experimento de Stage-Conversion, mostrando que estes genes mudam seu número de cópias a depender do estágio em que a Leishmania se encontra. Assim, os alvos de amplificação localizados no minicírculo são constantes, independente de onde se encontre a leishmania (flebotomieo ou dentro do macrófago) enquanto que os alvos do maxicírculo são diferenciáveis (no flebotomieo e no macrófago). O artigo também especula a possibilidade do parasito estar infectando bolsas de sangue, que foi material de estudo do meu mestrado. Ficamos por aqui até a próxima pessoal.

Proteomica para escolha de novos antígenos para vacina e diagnóstico na leishmaniose

Legenda: Superior esquerdo – extrato de promastigotas (Verde)

Superior direito – Amastigotas (Vermelho)

Inferior esquerdo – Padrão / Controle

Inferior direito – Sobreposição de amastigotas e promastigotas (amarelo para sobreposições)

Post de Leonardo Arruda

Com objetivo de identificar novos antígenos, foi publicadono ano passado um trabalho (Analysis of Leishmania chagasi by 2-D Difference Gel Eletrophoresis (2-D DIGE) and Immunoproteomic: Identification of Novel Candidate Antigens for Diagnostic Tests and Vaccine; DOI: 10.1021/pr101286y) que comparou o perfil proteômico de Leishmania chagasi entre proteínas de amastigotas contra promastigotas.

Para isso, os autores utilizaram uma combinação de poderosas ferramentas, como DIGE-2D, Western Blot 2D e MaldiTof, seguidas por uma análise através de softwares. 

Foram visualizados 900 spots, entre amastigotas e promastigotas (figura 1 DIGE-2D). Dentre eles, foram retirados 113 spots para identificação da proteína por Maldi-Tof. Cinco proteínas foram especificamente identificadas como pertencentes a fase amastigota, 25 únicas para a fase promastigota e 10 proteínas identificadas como presentes tanto nas fases amastigota quanto promastigota. Além disso, 41 proteínas foram identificadas usando soro de cães infectados por Western blot 2D, que entre elas, 3 foram reativas a IgM e 38 reativas a IgG total. Os autores também mapearam os epítopos para células B utilizando um arranjo de peptídios com soro de cães. O mapeamento de 180 epítopos para células T CD8+ foi realizado in silico para todas as proteínas reconhecidas por Western blot, e ao final, os autores encontraram 25 peptídios que poderão ser utilizados para diagnóstico ou desenvolvimento de vacinas para cães, baseados em sua reatividade com células B e T.

Mais ainda, entre as proteínas com o maior escore de imunogenicidade havia 19 proteínas com função hipotética e outras 7 com função putativa, o que agregou importantes informações para o conhecimento da função destas proteínas, já que não havia prévia descrição no que se refere a relação  hospedeiro X Leishmania.

O artigo poderá ser encontrado na íntegra aqui.

Detecção de Leishmania infantum por RT-PCR usando swab na cavidade oral e na conjuntiva de cães

Post de Rayssa Carvalho

O diagnóstico da leishmaniose visceral canina é uma tarefa complexa devido ao vasto espectro de sinais clínicos. Cães infectados podem desenvolver a doença clínica ou permanecer assintomáticos. Técnicas parasitológicas, sorológicas e moleculares são utilizadas sozinhas ou combinadas a fim de fornecer um diagnóstico preciso. 

O baço, linfonodo, medula óssea e pele são consideradas as melhores amostras na detecção do parasita por PCR, tanto em animais doentes quanto subclíncos. Entretanto, a obtenção dessas amostras é feita através de métodos invasivos, dessa forma, cresce o interesse pele uso de amostras não-invasivas na detecção de DNA de Leishmania.

Pesquisas realizadas com urina demonstraram uma baixa sensibilidade, na técnica de PCR, quando comparados à medula óssea e sangue. Em um estudo longitudinal realizado por Gramicia et al, 2010, utilizou-se DNA da mucosa conjuntival para realização do PCR, observou-se uma lenta conversão dos animais negativos para positivos, mesmo na ausência de seroconversão.

Neste estudo avaliou-se a presença de DNA de leishmania em swabs da mucosa conjuntival e oral, por PCR em tempo real, em uma população canina randomicamente selecionada numa área endêmica para a doença. Essas amostras, não-invasivas, foram comparadas com amostras de sangue e linfonodo por PCR em tempo real e com as técnicas de imunofluorescência indireta e teste de hipersensibilidade tardia (DTH).

Este estudo demonstrou pela primeira vez a presença de DNA de Leishmania em swabs da mucosa oral íntegra em cães. Os sawbs orais obtiveram uma maior percentagem de resultados positivos quando comparados com sangue, pela técnica de PCR em tempo real. Entretanto este tipo de amostra não pode ser considerado uma ferramenta sensível para o diagnostico da Leishmaniose canina, uma vez que demonstrou uma baixa sensibilidade na detecção de cães soropositivos (15%).

A carga parasitária de aspirado de linfonodo foi positivamente correlacionada com a carga encontrada em swabs da mucosa conjuntival (Pearson r=0,29;p< 0,0001). Além disso, observou-se uma correlação positiva entre os títulos de anticorpos e carga parasitária de swabs da mucosa conjuntival (Pearson r=0,27;p<0,0003), da mucosa oral (Pearson r=o,22;p<0,007) e aspirado de linfonodo (Pearson r=0,33;p<0,0001).

Uma vez que foi observado uma percentagem de positividade similar, por PCR em tempo real, nas amostras de swabs da mucosa conjuntival e do aspirado de linfonodo, sugere-se a utilização destes swabs como uma alternativa na detecção de infecção por Leishmania em cães. Esse dado é de grande importância, principalmente em estudos epidemiológicos, onde uma  quantidade grande de cães é necessária e a utilização de amostras não-invasivas tornaria o diagnóstico mais fácil e rápido.

Referencias:

Lombardo, G., Pennisi, M., Lupo, T., Migliazzo, A., Caprì, A., & Solano-Gallego, L. (2012). Detection of Leishmania infantum DNA by real-time PCR in canine oral and conjunctival swabs and comparison with other diagnostic techniques Veterinary Parasitology, 184 (1), 10-17 DOI: 10.1016/j.vetpar.2011.08.010

Maia, C., Campino, L., 2008. Methods for diagnosis of canine leishmaniasis and immune response to infection. Vet. Parasitol. 158, 274–287.

Gramiccia, M., Bettini, S., Gradoni, L., Ciarmoli, P., Verrilli, M.L., Loddo, S., Cicalo, C., 1990. Leishmaniasis in Sardinia. Leishmanin reaction in the human population of a focus of low endemicity of canine leishmaniasis. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84, 371–374.

Solano-Gallego, L., Rodriguez-Cortes, A., Trotta, M., Zampieron, C., Razia,L., Furlanello, T., Caldin, M., Roura, X., Alberola, J., 2007. Detection of Leishmania infantum DNA by fret-based real-time PCR in urine from dogs with natural clinical leishmaniosis. Vet. Parasitol. 147, 315–319.

Uso de proteínas recombinantes para diagnóstico por ELISA na leishmaniose canina

Post de Ana Paula de Almeida Souza

O diagnóstico efetivo e precoce é um passo determinante para tomada de decisões nas leishmanioses, sejam elas em seres humanos ou cães. Para isso, a detecção do parasito é tido como padrão ouro, porém, apesar da grande especificidade, nem sempre apresenta sensibilidade satisfatória. Devido a isto, os testes indiretos, baseados na resposta imune do hospedeiro são amplamente empregados. O método de ELISA utilizando antígeno bruto de Leishmania (SLA) é comumente usado para diagnosticar as leishmanioses, em especial a LV. Embora o SLA apresente alta sensibilidade, alguns antígenos parasitários apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos, além de nem sempre apresentarem reprodutibilidade dos resultados. Uma estratégia para superar estas limitações seria a busca de antígenos recombinantes de Leishmania combinando altos valores de sensibilidade e especificidade. 

Neste mês, De Souza e colaboradores [1] publicaram um trabalho que abrange a expressão, isolamento e purificação de duas proteínas recombinantes da L. chagasi, seguido da padronização do sorodiagnóstico para cães com Leishmaniose Visceral.  Para isso os autores contaram com um grande painel de 256 soros de cães provenientes do sudoeste, nordeste e centro oeste do Brasil. As proteínas descritas neste trabalho rLci 2B (homóloga a proteína do citoesqueleto) e rLci 1A (homóloga a proteína de choque térmico HSP70) foram produzidas em grande quantidade em E. coli, com rendimento em torno de 105 e 225 mg/L de cultura respectivamente. Foram obtidos altos valores de especificidade (SP) e sensibilidade (SE) nas sorologia (ELISA) para a  rLci 2B (95% e 100%) e rLci 1A (92 e 96%). As proteínas recombinantes não apresentaram reação cruzada com soro de cães infectados com Trypanosoma caninum, Babesia canis e Ehrlichia canis, entretanto foi observada reatividade contra soros obtidos de cães infectados por L. braziliensis (5,81%).

Muitas são as proteínas já descritas na literatura que apresentam elevada performance para o sorodiagnóstico da LV. Os autores chamam atenção que a maior parte destes trabalhos foram realizados a partir de pequenos painéis de soros de cães, e, além disso, estas proteínas apresentam baixo rendimento por litro de cultura.  A reação cruzada contra soro de cães com L. braziliensis deve-se provavelmente à proximidade taxonômica destes parasitos, e não compromete a eficiência das proteínas testadas, já que também é preconizado pelo Ministério da Saúde o sacrifício de cães com LC.  

Em suma, De Souza e colaboradores [1] propõem que ambas as proteínas rLci 2B e rLci 1A podem ser utilizadas como antígenos alternativos para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Visceral canina.

De Souza CM, Silva ED, Ano Bom AP, Bastos RC, Nascimento HJ, Da Silva Junior JG 2012. Evaluation of an ELISA for canine leishmaniasis immunodiagnostic using recombinant proteins. Parasite Immunol., 34(1), pp.1–7. PMID:21929686

The British Medical Journal Group Awards: teste diagnóstico para a tuberculose concorre a prêmio de medicina baseada em evidências

Post de Theolis Bessa

O BMJ Group Awards premia contribuições de excelência com efeitos mensuráveis para o cuidado em saúde. Este ano, o prêmio será entregue em 18 de maio no London Hilton em Park Lane.

O Projeto de Tuberculose da equipe do Dr. Richard Feinmann do Hospital Internacional de Kampala, Uganda concorre para o prêmio Getting Evidence into Practice de 2011, com a introdução do teste de baixo custo para o diagnóstico da tuberculose baseado na cultura líquida de amostras de escarro (Microscopic Observed Technique, MOT). O teste foi desenvolvido no Peru (com o nome de Microscopic Observation broth-Drug Susceptibility assay, MODS) para o diagnóstico rápido de tuberculose e susceptibilidade a drogas [1].

O MOT apresentou elevada sensibilidade e especificidade quando confrontado com o sistema de cultura líquida Bactec 960 MGIT, e seu custo é 14 vezes menor, além de ser de fácil execução e implementação, não requerer infraestrutura em nível de segurança biológica 2/3 e possibilitar a entrega de resultados no período de 10 dias [1]. A introdução do teste no Hospital Internacional de Kampala levou ao aumento das taxas de diagnóstico e tratamento de pacientes com tuberculose e representou um passo para o melhor controle da doença na região.

Para saber mais sobre o MOT, consulte o documento preliminar endossado pelo Strategic and Technical Advisory Group for Tuberculosis (STAG-TB) da Organização Mundial de Saúde.

Outras categorias de contribuições para a medicina também serão contempladas, incluindo o “artigo científico do ano” (para o qual concorrem três ensaios clínicos publicados no Lancet), e “contribuição de carreira - lifetime achievement”. Assentos ainda estão disponíveis, por £228....


Referências

[1] L. Caviedes, T.S. Lee, R.H. Gilman, P. Sheen, E. Spellman, E.H. Lee, et al., Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures. The Tuberculosis Working Group in Peru, J. Clin. Microbiol. 38 (2000) 1203-1208.

Biosensores no diagnóstico de leishmaniose

Post de Diego Moura

A leishmaniose é uma doença parasitária negligenciada que afeta 12 milhões de pessoas; mais de 350 milhões estão em risco de contrair a doença. A doença é causada pela Leishmania spp., transmitida pelo flebótomo infectado. Muitos grupos de pesquisa focam seus trabalhos nos desenvolvimento de novas estratégias de tratamento e em sistemas de diagnóstico de baixo custo. Apesar destes esforços, os métodos diagnósticos existentes não são eficazes, com limitações em termos de custos, sensibilidade e especificidade, dificultando a utilização em testes em campo. Em relação à especificidade, ocorre reação cruzada, sobretudo com a Doença de Chagas, e também com a Tuberculose e a Hanseníase.

A tabela abaixo exemplifica alguns métodos de detecção para leishmaniose:

Métodos de detecção	Comentários
Cultura de parasitas	-Material obtido por métodos invasivos -Positivo em alguns casos - Problemas com contaminação  -Demanda tempo
Imunoensaios	-Limitado no caso de LT* devido ao baixo nível de anticorpos
Análise molecular (PCR)	-Preço proibitivo para diagnóstico em larga escala

 *LT – Leishmaniose Tegumentar

As limitações envolvidas nos métodos para diagnóstico de leishmaniose motivaram o grupo de Valtencir Zucolotto a publicar, no ano corrente, um trabalho intitulado “Biosensors for Efficient Diagnosis of  Leishmaniasis: Innovations in Bioanalytics for a Neglected Disease”.  No referido trabalho, o grupo desenvolveu um sistema de biosensores, empregando biomatérias nanoestruturadas.  Este sistema é capaz de detectar analitos, via reconhecimento específico, com base na interação entre a proteína e os ligantes, ou entre antígenos e anticorpos. Esta metodologia apresenta alta sensibilidade e especificidade, como foi demonstrada para a detecção da Pasteurelose (Zucoloto et al., 2007). A detecção é feita através de medições elétricas em que o material bioreceptor é imobilizado nas lacunas do eletrodo e imerso em soluções aquosas, contendo diferentes concentrações de analito. Diferenças na capacitância elétrica dos eletrodos são correlacionadas com o tipo e a concentração dos analitos, utilizando circuitos elétricos equivalentes. Estes circuitos representam o sistema experimental, o qual é composto por faixas metálicas cobertas com uma camada de bioreceptores, imersos em um eletrólito. O grupo testou soro de camundongos infectados com L. amazonensis ou T. cruzi, nas concentrações de 10^-2 a 10^-10 mg/mL (diluído em tampão). Como pode ser observado na Fig. 5, os eletrodos conseguiram distinguir entre os dois grupos de amostras de soro; os dados relativos às amostras positivas (L. amazonensis) estavam localizadas no lado direito do plot, enquanto os dados das amostras negativas (T. cruzi) estavam no lado esquerdo do plot. Este método diagnóstico também foi capaz de detectar amostras de soro diluídas (10^-10 mg/mL). 

Este trabalho demonstrou a eficácia da metodologia dos biosensores no diagnóstico da Leishmaniose. Esta técnica apresenta pontos positivos como alta sensibilidade, especificidade e baixo custo. Entretanto, ensaios necessitam ser realizados, com amostras de soros humanos infectados com Leishmania e outras doenças responsáveis pelas reações cruzadas como na Doença de Chagas, Tuberculose e Hanseníase.

Perinoto, A., Maki, R., Colhone, M., Santos, F., Migliaccio, V., Daghastanli, K., Stabeli, R., Ciancaglini, P., Paulovich, F., de Oliveira, M., & Zucolotto, V. (2010). Biosensors for Efficient Diagnosis of Leishmaniasis: Innovations in Bioanalytics for a Neglected Disease Analytical Chemistry, 82 (23), 9763-9768 DOI: 10.1021/ac101920t

Sobre curvas ROC

Trabalho do LIMI e do LIP no topo dos mais citados do Malaria Journal

Notícia para o pessoal dos laboratórios LIMI e LIP:

O trabalho sobre diagnóstico na malária está hoje no topo da lista dos mais acessados no Malaria Journal.

Algumas reflexões:

O tema da malária é bastante atraente;

Os assuntos com aplicação na prática, como diagnóstico, têm um público importante;

O comentário acima não pretende desmerecer os estudos sem aplicação prática imediata ( o artigo sobre o 'toró' de citocinas na malária também foi altamente acessado).

A ver:

Estes acessos se reverterão em citações?
Veja o artigo.

Diagnóstico da Malária na Amazônia Brasileira

Figure 2 Def MS Dx

O diagnóstico preciso da malária é fundamental para o manejo adequado dos casos e controle da doença. Diversos métodos diagnósticos estão disponíveis, mas por razões de custo-benefício, o exame da gota espessa (microscopia) permanece como o padrão ouro. Um estudo recente publicado pelo LIMI em colaboração com Luis Marcelo do ICB5/USP e com Ângelo Duarte da UEFS compara diferentes métodos diagnósticos em uma área endêmica da Amazônia brasileira. Além disso, o grupo desenvolve um software baseado em redes neurais artificiais (MalDANN) para o diagnóstico da malária assintomática.

O estudo revela que testes rápidos para o diagnóstico da malária podem encontrar um uso promissor na Amazônia brasileira, desde que integrem uma abordagem racional de diagnóstico. Apesar do baixo desempenho do MalDANN usando somente dados epidemiológicos, uma abordagem baseada em redes neurais pode ser quando métodos simples para discriminar as pessoas de acordo com o perfil de citocinas estejam disponíveis.

O artigo pode ser acessado em livremente no site do Malaria Journal.

Diagnóstico de parasitas com uma lanterna

A proposta é mesmo de fazer diagnóstico com uma lanterna. A lanterna é uma blacklight, o que é, segundo o The Free Dictionary: Black light (also Wood's light) is the common name for a lamp emitting electromagnetic radiation that is almost exclusively in the soft near ultraviolet range, and very little visible light. In many areas this type of lighting is more commonly referred to as simply "UV light". 

Bem, não é só uma black light. Precisa também de um corante, mas o corante é barato. Por outro lado, o diagnóstico pode ser feito para leishmaniose, Doença de Chagas e a tripanosomíase africana.  Esta é indicação do Wired Science para um produto da SRI International que foi apresentado no Congresso da American Chemical Society em 21 de março.

O corante se liga a uma molécula dos tripanosamatídeos, não presente no homem, e o torna fluorescente (veja a figura acima). A vantagem do teste deverá ser a sua facilidade de realização nas áreas endêmicas, por não requerer pessoal especializado em equipamentos sofisticados e ser rápido.

Eu não encontrei no sítio da SRI International referência a trabalhos que tenham avaliado o desempenho do teste. Sem uma avaliação apropriada do novo teste, este deve ser tomado como uma idéia promissora, mas com cautela.

Ilustração: Shine a blacklight on the dye alone, and it is almost perfectly clear. Mix it with a peptide that is produced by parasites, and it will turn fluorescent green./Elizabeth Wilson

Leishmaniose: Utilização de Real time, Western Blot e Elisa como ferramentas de diagnóstico

Post de Daniel Ruiz e Leonardo Arruda.

A convite de Barral, escrevemos sobre artigo “Canine leishmaniasis in south-east of France: Screening of Leishmania infantum antibodies (western blotting, ELISA) and parasitaemia”, publicado na Veterinary Parasitology em 2009.  Este é um trabalho de um grupo francês, que vem trabalhando com diferentes abordagens para identificação da leishmaniose canina e humana.

Com intuito de padronizar a amostra de estudo, os autores “recrutaram” 140 cães militares oriundos de países não endêmicos e que permaneciam com coleira impregnada por deltametrina. Em trabalho anterior destes autores, foi relatado que cães militares são mais susceptíveis a picadas de flebótomos do que cães que residem com civis.

O objetivo do estudo foi analisar a prevalência de portadores assintomáticos da leishmaniose canina, comparando a análise de parasitemia por qPCR com testes sorológicos (Elisa, utilizando proteína total de L. infantum e Western Blot (Wb) detectando as proteínas de 14 e 16 KDa previamente descritas por este mesmo grupo).

Para quantificação da carga parasitária, foi utilizado um qPCR amplificando um trecho do DNA do kinetoplasto. Este metodologia foi previamente utilizada em trabalho publicado por este mesmo grupo em 2004.

Dentre 58 cães com qPCR positivo apenas 1 era sintomático e apresentou o maior valor de parasitemia. Para os resultados sorológicos foram encontradas prevalências menores com 0,71% para o Elisa e 14% para o Western Blot. A concordância dos resultados (duplo positivos ou negativos) obtidos pelo qPCR e o Wb foi de 55% (77 cães). Dentre os cães cujo Western Blot foi positivo, a parasitemia também foi positiva (qPCR) em apenas 37% (7/19).

“Apart from the symptomatic dog, these low levels (parasitaemia) were most probably due to the presence of dozens or hundreds of copies of kinetoplastic DNA resulting from the destruction of L. infantum parasites by phagocytic cells (Mary et al., 2006). In other words, the low parasitaemia would be like the remains of a self-cured infection. Thus, only the symptomatic dog could have acted as a reservoir. As for the 12 dogs PCR (-) WB (+), they completely cleared the parasite’s DNA from their immune cells but still retain antibodies (at sampling time).”
(Note-se que 51 animais (37%) apresentaram qPCR positiva e Wb negativo.)

Em 2006, um artigo (Reference values for Leishmania infantum parasitemia in different clinical presentations: quantitative polymerase chain reaction for therapeutic monitoring and patient follow-up) relatou a presença do fragmento do DNA do kinetoplasto no sangue periférico de 58% dos indivíduos definidos como assintomáticos. Apenas 16% (13/77) tinham um Western Blot positivo. 

Os autores fazem uma série de especulações sobre o uso de coleiras com inseticidas. Também notaram a rápida velocidade de infecção dos cães após introdução na área endêmica (6 meses).

Concluem o trabalho enaltecendo o PCR sobre o Western Blot, e especulando sobre a vantagem de tratamento de cães assintomáticos.

A este respeito, ficamos com a dúvida: Aqueles cachorros que tem qPCR negativa e Wb positivo, o qPCR tem maior sensibilidade? Isto também nos leva a outras perguntas. Quem demora mais tempo em desaparecer do hospedeiro, o DNA do parasito ou a resposta humoral frente a ele? Há um padrão definido? A análise quantitativa da qPCR torna desnecessária a investigação da resposta humoral do hospedeiro (Wb) no diagnostico da LV canina e humana?

Ilustração: "Duelo a garrotazos" ou "La riña", de Goya.

Aoun, O., Mary, C., Roqueplo, C., Marié, J., Terrier, O., Levieuge, A., & Davoust, B. (2009). Canine leishmaniasis in south-east of France: Screening of Leishmania infantum antibodies (western blotting, ELISA) and parasitaemia levels by PCR quantification Veterinary Parasitology, 166 (1-2), 27-31 DOI: 10.1016/j.vetpar.2009.08.006

Mary C, Faraut F, Drogoul MP, Xeridat B, Schleinitz N, Cuisenier B, & Dumon H (2006). Reference values for Leishmania infantum parasitemia in different clinical presentations: quantitative polymerase chain reaction for therapeutic monitoring and patient follow-up. The American journal of tropical medicine and hygiene, 75 (5), 858-63 PMID: 17123977