Necroptose tem papel central no efeito letal do TNF

Post de Nívea F Luz

Na última edição de 2011 da Immunity foi publicado o artigo “RIP Kinase-Dependent Necrosis Drives Lethal Systemic Inflammatory Response Syndrome” que acrescenta bastante ao conhecimento de um importante fenômeno biológico, a necroptose. O termo necroptose é utilizado como sinônimo de necrose regulada, e na literatura denomina um caso específico de necrose que é iniciada pela ligação do TNF ao receptor 1 de TNF (TNFR1), além disso o termo necroptose pode ser usado para indicar necrose dependente de RIPK (receptor-interacting protein kinase )1 e RIPK3 (como ilustrado na figura abaixo). Esse tipo característico de necrose pode ser inibida quimicamente por Necrostatina-1 (inibidor da RIPK1) ou inibição genética da RIPK1/RIPK3 (Galluzzi et al., 2012).  

No artigo Duprez e colaboradores investigaram a síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS), que é uma reação inflamatória grave que afeta todo o corpo, e pode ser causada por infecções, tais como, sepse, ou por dano físico como queimaduras graves. Algo relevante sobre a SIRS é que o TNF tem um papel central na ocorrência da doença, ativando células para um perfil inflamatório e de morte celular programada. 

Inicialmente, com uma abordagem experimental de RNA de interferência em células in vitro, os autores submeteram células L929 à TNF recombinante e observaram que a necroptose induzida por TNF dependente de RIPK-1 e RIPK-3 é inibida pelo tratamento com z-VAD-fmk (um pan inibidor de caspase). Os autores silenciaram especificamente o RNA das caspase 3 e 7 (efetoras de apoptose) e caspase 8, e encontraram que apenas o silenciamento da caspase 8 implica na ocorrência de necroptose na célula. Um achado bastante interessante, uma vez que a caspase-8 é responsável pela clivagem de RIPK1 e RIPK3 e inativação dos seus efeitos “pró-necroptóticos”.  

Em seguida foi empregado um modelo experimental de SIRS, que consiste na injeção de TNF recombinante em camundongos, o que provoca uma inflamação sistêmica semelhante a SIRS e sepse. De fato a administração de TNF juntamente com z-VAD sensibiliza os camundongos ao choque induzido por TNF. Nessa etapa os autores utilizaram camundongos knockout para caspase 3, 7 e 1 (efetora da piroptose), e encontraram que essas caspases não são requeridas para a SIRS mediada por TNF. 

Os autores avançaram então para a investigação de um componente efetor da necroptose, a RIPK3 e acharam que camundongos knockout para esse gene são protegidos da SIRS induzida por TNF independente da presença ou ausência do inibidor de caspase. Além disso os autores encontraram que a proteção pela deleção da RIPK3 é acompanhada pela redução de morte celular, dano tecidual e inflamação persistente. Para investigar o papel da RIPK1 a Necrostatina foi utilizada como inibidor, uma vez que camundongos knockout para RIPK1 são inviáveis, os resultados foram semelhantes aos encontrados pela deleção de RIPK3.

Por fim, os autores utilizaram um modelo de sepse que inclui componentes microbianos, a ligação e perfuração cecal (CLP). De fato, a deleção de RIPK3 implica na proteção de camundongos da sepse ocasionada pela CLP. Esses camundongos exibiram menor liberação de padrões moleculares associados a dano (DAMP) na corrente sanguínea, e sobreviveram mais do que camundongos selvagens.  

Os achados de Duprez e colaboradores (resumidos da figura abaixo) demonstram em síntese, que em camundongos o bloqueio da necroptose confere proteção contra a SIRS letal.

Além disso, esse artigo é uma importante contribuição para a literatura por demonstrar que necroptose não é uma forma de morte celular acidental, mas que pode ocorrer de forma regulada por quinases e caspase inibidoras desse processo, dessa forma os achados reinforçam que RIPK desempenha um papel crucial na SIRS e sepse, o que pode configurar essa molécula como um alvo terapêutico para o tratamento dessas patologias.

Referências:

Duprez L, Takahashi N, Van Hauwermeiren F, Vandendriessche B, Goossens V, Vanden Berghe T, Declercq W, Libert C, Cauwels A, & Vandenabeele P (2011). RIP Kinase-Dependent Necrosis Drives Lethal Systemic Inflammatory Response Syndrome. Immunity, 35 (6), 908-18 PMID: 22195746

Galluzzi L et al, Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. v.19, n.1, 107-120. 2012.

Mycobacterium tuberculosis induz um modo atípico de morte celular para escapar de macrófagos infectados

Post de Thaís Peleteiro

A morte celular de macrófagos após a infecção pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb)desempenha um papel central na patogênese da tuberculose. Certas cepas atenuadas induzem apoptose de macrófagos infectados, no entanto cepas virulentas de Mtb suprimem esta resposta do hospedeiro.

Neste artigo publicado no final de março na revista Plos One, os autores discutem sobre as características da morte celular em macrófagos provenientes da medula óssea de camundongos C57/BL6 infectados com Mtb virulento (H37Rv) em alta taxa de infecção (MOI) [1]. Os autores já haviam apresentado que o Mtb virulento induz morte celular quando a carga bacilar excede aproximadamente 20 Mtb por macrófagos [2], mas a natureza exata dessa forma de morte ainda não está bem definida.

Os autores demonstram que a morte celular induzida pelo Mtb virulento envolve a permeabilização da membrana mitocondrial, com liberação de citocromo c e perda do potencial transmembrana, independente da regulação por Bax ou Bak, que atuam na via intrínseca da apoptose. Ocorre permeabilização da membrana lisossômica seguida pela destruição da bicamada lipídica e concomitante degradação de várias espécies de fosfolipídios presentes, havendo envolvimento de lipases lisossômicas. Diferente de muitos outros exemplos de morte celular lisossômica, a que é causada pelo Mtb independe de catepsinas B, L ou D. Também ocorreu na ausência da caspase-1 e de catepsina-B ativada, sendo assim, diferente da piroptose ou pironecrose, que constituem em formas de morte celular induzidas por outros patógenos a exemplo da Shigella, Salmonella, Fransciella ou Legionella.

Os autores implicaram a participação do sistema de sinal regulatório de dois componentes (PhoPR) do Mtb, na indução da permeabilização da membrana lisossômica, utilizando uma linhagem mutante (RvΔphoPR) incapaz de bloquear a fusão lisossômica [3]. A cepa mutante RvΔphoPR falhou em induzir a permeabilização da membrana lisossômica e em induzir lesão mitocondrial, e sua capacidade de induzir a morte de macrófagos foi significativamente atenuada.



A lesão mitocondrial (representada pela dissipação do potencial transmembrana) foi mensurada em macrófagos desafiados com a cepa H37Rv e comparados com macrófagos infectados com Mtb mutantes, que não apresentavam o gene espA (ΔRD1ΔespA; gráfico da esquerda) ou Mtb mutantes que não apresentavam o sistema de sinal regulatório de componentes PhoPR (ΔphoPR; gráfico do centro). No gráfico da direita, a morte celular, avaliada pela incorporação do iodeto de propídio (PI), foi verificada em macrófagos não infectados e macrófagos desafiados com a cepa H37Rv, RvΔRD1ΔespA ou RvΔphoPR (18h). A cepa mutante ΔphoPR foi incapaz de induzir a morte celular de macrófagos.


Os autores associam ao Mtb um novo mecanismo de morte celular mediado por lípases lisossômicas, e indicam que os genes micobacterianos codificantes do sistema de sinal regulatório de dois componentes PhoPR desempenham um papel importante, atuando na citotoxicidade e mecanismo de morte celular. Vale ressaltar que as características estruturais das células infectadas mostram condensação periférica da cromatina nuclear e protusão das membranas nucleares a partir das áreas da condensação da cromatina após 3h (associadas com apoptose, porém não foi verificada a condensação progressiva da cromatina nuclear nem a fragmentação do núcleo). Na fase tardia ou 18h após a infecção, observou-se exposição do citoesqueleto e de organelas intracelulares, rupturas na membrana plasmática, que definem a necrose, porém, sem aumento do volume celular. Essas características aproximam este tipo de morte da necroptose [4,5], embora os autores tenham demonstrado que a morte celular induzida pelo Mtb é independente de TNF [2].


Referências:
[1] Lee, J., Repasy, T., Papavinasasundaram, K., Sassetti, C., & Kornfeld, H. (2011). Mycobacterium tuberculosis Induces an Atypical Cell Death Mode to Escape from Infected Macrophages PLoS ONE, 6 (3) DOI: 10.1371/journal.pone.0018367
[2] J. Lee, H.G. Remold, M.H. Ieong, H. Kornfeld, Macrophage apoptosis in response to high intracellular burden of Mycobacterium tuberculosis is mediated by a novel caspase-independent pathway, J. Immunol. 176 (2006) 4267-4274.
[3] N.L. Ferrer, A.B. Gomez, O. Neyrolles, B. Gicquel, C. Martin, Interactions of Attenuated Mycobacterium tuberculosis phoP Mutant with Human Macrophages, PLoS ONE. 5 (2010) e12978.
[4] P. Vandenabeele, L. Galluzzi, T. Vanden Berghe, G. Kroemer, Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (2010) 700-714.
[5] L. Galluzzi, G. Kroemer, Necroptosis: A Specialized Pathway of Programmed Necrosis, Cell. 135 (2008) 1161-1163.