Peptídeos sintéticos para melhorar o imunodiagnóstico das leishmanioses humana e canina

Post de Rayssa Carvalho

A Leishmaniose Visceral é uma zoonose, causada pela Leishmania infantum, que tem como principal hospedeiro o cão. No Brasil, utiliza-se a Imunofluorescência indireta (RIFI) e o ELISA como principais testes diagnósticos. Entretanto, a especificidade e sensibilidade destas técnicas são comprometidas pelo uso de uma complexa mistura de antígenos, que reduz a acurácia destas favorecendo a manutenção de cães doentes, o que tem comprometido o controle da doença que é baseado na eliminação destes. Neste contexto o uso de combinações de antígenos, previamente definidos, aparece como uma alternativa favorável e que pode gerar melhores resultados. 

Com base nisso, o estudo com o título indicado acima do post (doi:10.1371/journal.pntd.0001622), testou combinações de peptídeos derivados de antígenos já utilizados no diagnóstico de Leishmaniose em soros de 106 cães e 44 pacientes humanos.

Os cães foram divididos em três grupos. O primeiro grupo é constituído por 14 soros negativos para leishmaniose; o segundo grupo é formado por soros de cães doentes, sendo 17 sintomáticos e 13 assintomáticos, oriundos de uma mesma área endêmica. O terceiro grupo é formado por 62 amostras, oriunda de diversas áreas endêmicas. Todos os soros foram testados sorologicamente (RIFI e ELISA) e parasitologicamente (PCR e esfregaço de medula óssea). Os soros positivos foram também divididos de acordo com a reatividade na RIFI em: baixa reatividade (n=20)(<1:320);intermediária (n=20)(>1:320<1:640) e alta reatividade (n=22)(>1:640).Os soros humanos foram obtidos de pacientes com Leishmaniose Visceral ativa.

As proteínas A2 (peptídeo 47), NH (peptídeo 17 e 18), LACK (peptídeo 19) e k39 (peptídeo 13) foram selecionadas de epítopos de células B, através de técnicas de bioinformática, e os peptídeos sintéticos derivados destas foram testados por ELISA nos soros selecionados.

Todos os peptídeos foram capazes de detectar os soros positivos tanto de cães sintomáticos como dos assintomáticos. Uma alta sensibilidade (100%) foi detectada em todos os peptídeos quando foram testados, individualmente, em cães com alta reatividade na RIFI. Entretanto, houve uma diminuição dessa sensibilidade, quando foram testados os soros de intermediaria a baixa reatividade na RIFI.

Para testar a hipótese de que a combinação de peptídeos poderia aumentar a sensibilidade do ELISA na detecção de LV, os autores fizeram combinações de dois peptídeos cada, e testaram nos soros de cães com baixa e intermediaria reatividade.

Nos soros com baixa reatividade, os peptídeos 13 e19, e 47 e 18 apresentaram os melhores resultados, com sensibilidade de 95% e especificidade de 100%.

Nos soros humanos selecionados, os peptídeos 17 e 19, individualmente, obtiveram os melhores resultados com uma sensibilidade de 100% e especificidade de 81% e 94%, respectivamente (Tabela 3). A combinação de peptídeos aumentou a sensibilidade e especificidade entre os peptídeos 13 e 19, 18 e 19, e 13 e 47 com sensibilidade de 100% e especificidade variando de 93% e 100% (Tabela 3)

Portanto, a combinação de peptídeos sintéticos identificados a partir de epítopos de células B, pode ser uma ferramenta útil no desenvolvimento de testes sorológicos com alta sensibilidade e especificidade na leishmaniose visceral humana e canina. 

Perfil de citocinas e fenotipagem celular na leishmaniose canina

Post de Eder Fialho

No artigo de revisão “Cytokine and Phenotypic Cell Profiles of Leishmania infantum Infection in the Dog” publicado no Journal of Medicine Tropical, as autoras Carla Maia e Lenea Campino reúnem informações sobre o perfil de citocinas e a imunofenotipagem de células nos principais órgãos e tecidos acometidos na leishmaniose canina. Elas enfatizam a necessidade de caracterizar melhor os mecanismos da resposta imune para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficientes.

O paradigma Th1 e Th2 que envolve o mecanismo de resistência e susceptibilidade, respectivamente, na leishmaniose visceral canina, explica cada vez menos a resposta imune ao parasito. Isso se torna mais evidente quando se caracteriza a resposta de forma órgão-específico, onde as citocinas encontradas e a imunofenotipagem das células muitas vezes contradizem o paradigma mencionado acima, revelando que o os sistemas do hospedeiro não respondem da mesma forma.

Menezes-Sousa e colaboradores mostraram que na pele de cães naturalmente infectados, o quadro assintomático e baixo parasitismo estão associados tanto com a expressão de IFN-γ, TNF-α e IL-13 como também com o aumento da expressão de fatores de transcrição GATA-3 e FOXP-3. Da mesma forma, o estudo realizado por Strauss-Ayali e colaboradores indicou que tanto a reposta imune tipo-1 e tipo-2 ocorrem no baço de cães experimentalmente infectados. Visto isso, as autoras revisaram a resposta imune no sangue periférico, linfonodo, fígado, baço, medula óssea e pele de cães infectados com Leishmania infatum.

Essa revisão ressaltou a falibilidade dos marcadores para prognósticos na leishmaniose canina. A ideia de que a expressão de IFN-γ seria um bom marcador para cães resistentes ou assintomáticos, não foi confirmada em estudos que observaram altos níveis de expressão de IFN-γ no sangue periférico de cães sintomáticos. 

Pode-se até questionar que o sangue não é o local alvo para a replicação do parasito e por isso não refletir a evolução da doença. Entretanto, o baço, a medula óssea e o fígado, são órgãos onde se encontra uma alta carga parasitária, entretanto, expressando também altos níveis de IFN-γ, indicando que essa citocina não é um bom indicativo da eliminação do parasito.

Do ponto de vista celular, a imunofenotipagem ainda revela muitos resultados contraditórios entre os órgãos, indicando que ainda é necessária mais investigações para estabelecer o perfil celular de resistência ou susceptibilidade ao parasito.

Portanto, o artigo revela claramente a necessidade de mais investigações sobre os mecanismos da resposta imunológica montada em órgãos específicos, pois ainda existem muitos resultados contraditórios, deixando uma lacuna na definição de bons marcadores para prognóstico da leishmaniose canina.

Maia, C., & Campino, L. (2012). Cytokine and Phenotypic Cell Profiles of Leishmania infantum Infection in the Dog Journal of Tropical Medicine, 2012, 1-7 DOI: 10.1155/2012/541571

Detecção de Leishmania infantum por RT-PCR usando swab na cavidade oral e na conjuntiva de cães

Post de Rayssa Carvalho

O diagnóstico da leishmaniose visceral canina é uma tarefa complexa devido ao vasto espectro de sinais clínicos. Cães infectados podem desenvolver a doença clínica ou permanecer assintomáticos. Técnicas parasitológicas, sorológicas e moleculares são utilizadas sozinhas ou combinadas a fim de fornecer um diagnóstico preciso. 

O baço, linfonodo, medula óssea e pele são consideradas as melhores amostras na detecção do parasita por PCR, tanto em animais doentes quanto subclíncos. Entretanto, a obtenção dessas amostras é feita através de métodos invasivos, dessa forma, cresce o interesse pele uso de amostras não-invasivas na detecção de DNA de Leishmania.

Pesquisas realizadas com urina demonstraram uma baixa sensibilidade, na técnica de PCR, quando comparados à medula óssea e sangue. Em um estudo longitudinal realizado por Gramicia et al, 2010, utilizou-se DNA da mucosa conjuntival para realização do PCR, observou-se uma lenta conversão dos animais negativos para positivos, mesmo na ausência de seroconversão.

Neste estudo avaliou-se a presença de DNA de leishmania em swabs da mucosa conjuntival e oral, por PCR em tempo real, em uma população canina randomicamente selecionada numa área endêmica para a doença. Essas amostras, não-invasivas, foram comparadas com amostras de sangue e linfonodo por PCR em tempo real e com as técnicas de imunofluorescência indireta e teste de hipersensibilidade tardia (DTH).

Este estudo demonstrou pela primeira vez a presença de DNA de Leishmania em swabs da mucosa oral íntegra em cães. Os sawbs orais obtiveram uma maior percentagem de resultados positivos quando comparados com sangue, pela técnica de PCR em tempo real. Entretanto este tipo de amostra não pode ser considerado uma ferramenta sensível para o diagnostico da Leishmaniose canina, uma vez que demonstrou uma baixa sensibilidade na detecção de cães soropositivos (15%).

A carga parasitária de aspirado de linfonodo foi positivamente correlacionada com a carga encontrada em swabs da mucosa conjuntival (Pearson r=0,29;p< 0,0001). Além disso, observou-se uma correlação positiva entre os títulos de anticorpos e carga parasitária de swabs da mucosa conjuntival (Pearson r=0,27;p<0,0003), da mucosa oral (Pearson r=o,22;p<0,007) e aspirado de linfonodo (Pearson r=0,33;p<0,0001).

Uma vez que foi observado uma percentagem de positividade similar, por PCR em tempo real, nas amostras de swabs da mucosa conjuntival e do aspirado de linfonodo, sugere-se a utilização destes swabs como uma alternativa na detecção de infecção por Leishmania em cães. Esse dado é de grande importância, principalmente em estudos epidemiológicos, onde uma  quantidade grande de cães é necessária e a utilização de amostras não-invasivas tornaria o diagnóstico mais fácil e rápido.

Referencias:

Lombardo, G., Pennisi, M., Lupo, T., Migliazzo, A., Caprì, A., & Solano-Gallego, L. (2012). Detection of Leishmania infantum DNA by real-time PCR in canine oral and conjunctival swabs and comparison with other diagnostic techniques Veterinary Parasitology, 184 (1), 10-17 DOI: 10.1016/j.vetpar.2011.08.010

Maia, C., Campino, L., 2008. Methods for diagnosis of canine leishmaniasis and immune response to infection. Vet. Parasitol. 158, 274–287.

Gramiccia, M., Bettini, S., Gradoni, L., Ciarmoli, P., Verrilli, M.L., Loddo, S., Cicalo, C., 1990. Leishmaniasis in Sardinia. Leishmanin reaction in the human population of a focus of low endemicity of canine leishmaniasis. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84, 371–374.

Solano-Gallego, L., Rodriguez-Cortes, A., Trotta, M., Zampieron, C., Razia,L., Furlanello, T., Caldin, M., Roura, X., Alberola, J., 2007. Detection of Leishmania infantum DNA by fret-based real-time PCR in urine from dogs with natural clinical leishmaniosis. Vet. Parasitol. 147, 315–319.

Uso de proteínas recombinantes para diagnóstico por ELISA na leishmaniose canina

Post de Ana Paula de Almeida Souza

O diagnóstico efetivo e precoce é um passo determinante para tomada de decisões nas leishmanioses, sejam elas em seres humanos ou cães. Para isso, a detecção do parasito é tido como padrão ouro, porém, apesar da grande especificidade, nem sempre apresenta sensibilidade satisfatória. Devido a isto, os testes indiretos, baseados na resposta imune do hospedeiro são amplamente empregados. O método de ELISA utilizando antígeno bruto de Leishmania (SLA) é comumente usado para diagnosticar as leishmanioses, em especial a LV. Embora o SLA apresente alta sensibilidade, alguns antígenos parasitários apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos, além de nem sempre apresentarem reprodutibilidade dos resultados. Uma estratégia para superar estas limitações seria a busca de antígenos recombinantes de Leishmania combinando altos valores de sensibilidade e especificidade. 

Neste mês, De Souza e colaboradores [1] publicaram um trabalho que abrange a expressão, isolamento e purificação de duas proteínas recombinantes da L. chagasi, seguido da padronização do sorodiagnóstico para cães com Leishmaniose Visceral.  Para isso os autores contaram com um grande painel de 256 soros de cães provenientes do sudoeste, nordeste e centro oeste do Brasil. As proteínas descritas neste trabalho rLci 2B (homóloga a proteína do citoesqueleto) e rLci 1A (homóloga a proteína de choque térmico HSP70) foram produzidas em grande quantidade em E. coli, com rendimento em torno de 105 e 225 mg/L de cultura respectivamente. Foram obtidos altos valores de especificidade (SP) e sensibilidade (SE) nas sorologia (ELISA) para a  rLci 2B (95% e 100%) e rLci 1A (92 e 96%). As proteínas recombinantes não apresentaram reação cruzada com soro de cães infectados com Trypanosoma caninum, Babesia canis e Ehrlichia canis, entretanto foi observada reatividade contra soros obtidos de cães infectados por L. braziliensis (5,81%).

Muitas são as proteínas já descritas na literatura que apresentam elevada performance para o sorodiagnóstico da LV. Os autores chamam atenção que a maior parte destes trabalhos foram realizados a partir de pequenos painéis de soros de cães, e, além disso, estas proteínas apresentam baixo rendimento por litro de cultura.  A reação cruzada contra soro de cães com L. braziliensis deve-se provavelmente à proximidade taxonômica destes parasitos, e não compromete a eficiência das proteínas testadas, já que também é preconizado pelo Ministério da Saúde o sacrifício de cães com LC.  

Em suma, De Souza e colaboradores [1] propõem que ambas as proteínas rLci 2B e rLci 1A podem ser utilizadas como antígenos alternativos para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Visceral canina.

De Souza CM, Silva ED, Ano Bom AP, Bastos RC, Nascimento HJ, Da Silva Junior JG 2012. Evaluation of an ELISA for canine leishmaniasis immunodiagnostic using recombinant proteins. Parasite Immunol., 34(1), pp.1–7. PMID:21929686

Transmissão transplacentária de Leishmania infantum

Post de Rômulo Santiago (LIP/CPqGM-FIOCRUZ)

A leishmaniose visceral zoonótica (ZVL) é um sério problema de saúde pública nos Estados Unidos, uma vez que: i) os cães são os reservatórios domésticos preferíveis para flebotomíneos, que transmitem a infecção por L. infantum a humanos, e ii) que a prevalência anual de animais PCR positivo para Leishmania tem crescido. A contenção desta doença está associada à eutanásia dos animais infectados e ao controle do vetor. Contudo, o meio de transmissão de L. infantum em cães da América do Norte, fora de regiões endêmicas, não era totalmente conhecido, sendo possível ocorrer via vertical/transplacentária e horizontal/venérea. Assim, para avaliar a possibilidade de transmissão placentrária e seu efeito sobre a resposta imune contra Leishmania, os autores deste estudo utilizaram-se de uma cadela grávida e infectada por L. infantum doada à Universidade Estadual de Iowa. Dos doze filhotes nascidos oito foram eutanasiados no pós-parto recente (24hs) e quatro após três meses, sendo avaliados quanto à presença de Leishmania através de PCR quantitativo para cinetoplasto de L. infantum (kqPCR) e histopatologia e a resposta imune através ensaio de proliferação celular. Dez dos doze filhotes apresentaram kqPCR positivo em vários tecidos indicando infecção disseminada, apesar de não apresentarem lesão macroscópica ou histológica. Além disso, todos apresentaram resposta imune proliferativa de célula T CD4+ específica para L. infantum. Deste modo, esta forma de transmissão poderia sustentar a infecção nesta população, colocando-se como um novo desafio para o controle da ZVL.

Boggiatto, P., Gibson-Corley, K., Metz, K., Gallup, J., Hostetter, J., Mullin, K., & Petersen, C. (2011). Transplacental Transmission of Leishmania infantum as a Means for Continued Disease Incidence in North America PLoS Neglected Tropical Diseases, 5 (4) DOI: 10.1371/journal.pntd.0001019

Leishmaniose: Utilização de Real time, Western Blot e Elisa como ferramentas de diagnóstico

Post de Daniel Ruiz e Leonardo Arruda.

A convite de Barral, escrevemos sobre artigo “Canine leishmaniasis in south-east of France: Screening of Leishmania infantum antibodies (western blotting, ELISA) and parasitaemia”, publicado na Veterinary Parasitology em 2009.  Este é um trabalho de um grupo francês, que vem trabalhando com diferentes abordagens para identificação da leishmaniose canina e humana.

Com intuito de padronizar a amostra de estudo, os autores “recrutaram” 140 cães militares oriundos de países não endêmicos e que permaneciam com coleira impregnada por deltametrina. Em trabalho anterior destes autores, foi relatado que cães militares são mais susceptíveis a picadas de flebótomos do que cães que residem com civis.

O objetivo do estudo foi analisar a prevalência de portadores assintomáticos da leishmaniose canina, comparando a análise de parasitemia por qPCR com testes sorológicos (Elisa, utilizando proteína total de L. infantum e Western Blot (Wb) detectando as proteínas de 14 e 16 KDa previamente descritas por este mesmo grupo).

Para quantificação da carga parasitária, foi utilizado um qPCR amplificando um trecho do DNA do kinetoplasto. Este metodologia foi previamente utilizada em trabalho publicado por este mesmo grupo em 2004.

Dentre 58 cães com qPCR positivo apenas 1 era sintomático e apresentou o maior valor de parasitemia. Para os resultados sorológicos foram encontradas prevalências menores com 0,71% para o Elisa e 14% para o Western Blot. A concordância dos resultados (duplo positivos ou negativos) obtidos pelo qPCR e o Wb foi de 55% (77 cães). Dentre os cães cujo Western Blot foi positivo, a parasitemia também foi positiva (qPCR) em apenas 37% (7/19).

“Apart from the symptomatic dog, these low levels (parasitaemia) were most probably due to the presence of dozens or hundreds of copies of kinetoplastic DNA resulting from the destruction of L. infantum parasites by phagocytic cells (Mary et al., 2006). In other words, the low parasitaemia would be like the remains of a self-cured infection. Thus, only the symptomatic dog could have acted as a reservoir. As for the 12 dogs PCR (-) WB (+), they completely cleared the parasite’s DNA from their immune cells but still retain antibodies (at sampling time).”
(Note-se que 51 animais (37%) apresentaram qPCR positiva e Wb negativo.)

Em 2006, um artigo (Reference values for Leishmania infantum parasitemia in different clinical presentations: quantitative polymerase chain reaction for therapeutic monitoring and patient follow-up) relatou a presença do fragmento do DNA do kinetoplasto no sangue periférico de 58% dos indivíduos definidos como assintomáticos. Apenas 16% (13/77) tinham um Western Blot positivo. 

Os autores fazem uma série de especulações sobre o uso de coleiras com inseticidas. Também notaram a rápida velocidade de infecção dos cães após introdução na área endêmica (6 meses).

Concluem o trabalho enaltecendo o PCR sobre o Western Blot, e especulando sobre a vantagem de tratamento de cães assintomáticos.

A este respeito, ficamos com a dúvida: Aqueles cachorros que tem qPCR negativa e Wb positivo, o qPCR tem maior sensibilidade? Isto também nos leva a outras perguntas. Quem demora mais tempo em desaparecer do hospedeiro, o DNA do parasito ou a resposta humoral frente a ele? Há um padrão definido? A análise quantitativa da qPCR torna desnecessária a investigação da resposta humoral do hospedeiro (Wb) no diagnostico da LV canina e humana?

Ilustração: "Duelo a garrotazos" ou "La riña", de Goya.

Aoun, O., Mary, C., Roqueplo, C., Marié, J., Terrier, O., Levieuge, A., & Davoust, B. (2009). Canine leishmaniasis in south-east of France: Screening of Leishmania infantum antibodies (western blotting, ELISA) and parasitaemia levels by PCR quantification Veterinary Parasitology, 166 (1-2), 27-31 DOI: 10.1016/j.vetpar.2009.08.006

Mary C, Faraut F, Drogoul MP, Xeridat B, Schleinitz N, Cuisenier B, & Dumon H (2006). Reference values for Leishmania infantum parasitemia in different clinical presentations: quantitative polymerase chain reaction for therapeutic monitoring and patient follow-up. The American journal of tropical medicine and hygiene, 75 (5), 858-63 PMID: 17123977