As condições de armazenamento, transporte e temperatura sazonal afetam a viabilidade das células mononucleares

Post de Elisabete Conceição (LIMI/CPqGM - Fiocruz)


A avaliação das condições de armazenamento e transferência de material biológico para a realização de ensaios imunológicos têm sido o objetivo de alguns estudos. Estes trabalhos relatam que a realização de ensaios clínicos em diferentes centros podem aumentar a variabilidade dos resultados devido a problemas no processamentos das amostras, como o intervalo entre a coleta e o processamento. O tempo e a temperatura de armazenamento afetam a viabilidade dos linfócitos quando o sangue é estocado “overnight” a 4ºC, ou quando armazenado a temperatura ambiente, afetando a separação das células mononuclares do sangue periférico (PBMC) por gradiente de Ficoll [1,2]. O estabelecimento de um protocolo padrão no transporte e armazenamento das amostras é um fator importante em estudos de doenças infecciosas. O transporte inadequado do sangue total altera a resposta linfoproliferativa a antígenos microbianos em indivíduos infectados pelo HIV e em doadores saudáveis [2]. Após 8 horas de armazenamento do sangue total ocorre acentuada diminuição na função imune celular [3].

Olson e colaboradores [4] procuram realizar uma ampla avaliação do efeito da temperatura e do transporte na viabilidade celular, neste estudo recém publicado no Journal of Translational Medicine, que investigou o impacto do clima, das condições de armazenamento e transporte na recuperação e função das PBMC’s de 285 pacientes envolvidos em dois ensaios clínicos de vacina para melanoma. Neste estudo as amostras de sangue foram coletadas em dois centros responsáveis por ensaios clínicos (em Houston e na Filadélfia) e enviadas para a Universidade da Virgínia em Charlottesville por correio durante nove meses (final do verão e início da primavera). As amostras de sangue foram monitoradas através de pacotes contendo um sensor para determinar a temperatura durante o transporte.

Os autores mostram que houve variação na temperatura dos pacotes contendo as amostras de acordo com a temperatura sazonal, de próximo a 0 até 40°C. Menores temperaturas obtidas no inverno estavam associadas com recuperação de menor número de células, enquanto que maiores temperaturas favoreceram a recuperação de células do sangue. O armazenamento de sangue total a 15°C ou a 40°C foi associado a menor recuperação de células após a criopreservação, e embora não tenham sido observadas diferenças na proporção de células CD4+, CD8+ ou CD56+, uma elevada proporção de células CD4+ e CD8+ sofreu apoptose após incubação por 8h em amostras que foram mantidas a 40°C antes da criopreservação. As células CD8+ foram as mais susceptíveis neste ensaio, e outras células mononucleares são bastante afetadas (Figura 3). Não houve diferença na detecção de células produtoras de IFN-gama por ELISpot nas várias condições testadas.





Em conclusão, para a manutenção das amostras em condições equivalentes ao armazenamento constante a 22°C, a temperatura satisfatória entre as testadas foi de 30°C. É desejável manter o transporte entre centros em uma variação de temperatura máxima entre 15°C e 35°C até o processamento das amostras.

[1] R.A. Betensky, E. Connick, J. Devers, A.L. Landay, M. Nokta, S. Plaeger, et al., Shipment impairs lymphocyte proliferative responses to microbial antigens, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7 (2000) 759-763.
[2] A. Weinberg, R.A. Betensky, L. Zhang, G. Ray, Effect of shipment, storage, anticoagulant, and cell separation on lymphocyte proliferation assays for human immunodeficiency virus-infected patients, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 5 (1998) 804-807.
[3] M. Bull, D. Lee, J. Stucky, Y.-L. Chiu, A. Rubin, H. Horton, et al., Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials, J. Immunol. Methods. 322 (2007) 57-69.
[4] Olson, W., Smolkin, M., Farris, E., Fink, R., Czarkowski, A., Fink, J., Chianese-Bullock, K., & Slingluff, C. (2011). Shipping blood to a central laboratory in multicenter clinical trials: effect of ambient temperature on specimen temperature, and effects of temperature on mononuclear cell yield, viability and immunologic function Journal of Translational Medicine, 9 (1) DOI: 10.1186/1479-5876-9-26

Muitos estudos experimentais são mal conduzidos, revela estudo.

A pesquisa científica em animais é essencial para o avanço científico, com consequente produção de conhecimentos capazes de melhorar a vida das pessoas. Evidentemente, tais pesquisas, ao implicar na utilização de seres vivos deve ser exercida com extrema cautela nas melhores condições possíveis. Devemos seguir, quando possível, as diretrizes de substituir, reduzir e evitar o sofrimento dos animais.

Apesar de tudo, ainda são essenciais pesquisas realizadas em animais. Quando isto é realizado é essencial que todo o processo seja feito estritamente  em obediência ao método científico para que as conclusões sejam confiáveis e utilizada adequadamente pela comunidade científica.

Um estudo baseado em que os experimentos envolvendo animais devem ser apropriadamente planejados, corretamente analisados e relatados de forma fidedigna foi divulgado pela PLoS One (4(11): e7824 em 30.11.2009). O relato “Survey of the Quality of Experimental Design, Statistical Analysis and Reporting of Research Using Animals” revela que as coisas não estão muito bem na literatura.

Os autores buscando informações mínimas indicadoras de qualidade que devem estar presentes em todos os estudos: examinaram o desenho experimental e a análise estatística de trabalhos publicados na literatura biomédica com uso de animais de laboratório (camundongos, ratos e primatas não-humanos) realizados nos EEUU ou Reino Unido e financiado por instituições financiadas com recursos públicos. 

Das 271 publicações examinadas eles obtiveram informação sobre: o objetivo ou hipótese do estudo, o número, sexo, idade e/ou peso dos animais usados e os métodos experimentais e estatísticos. 

Somente 59% dos estudos indicava a hipótese ou objetivo do estudo e as características dos animais usados.

No desenho experimental a situação é ainda um pouco pior: 87% dos estudos não indicava randomização e 86% não relatava cegamento para reduzir o viés de seleção animal e avaliação de desfecho.

Também terrível, somente 70% das publicações que usaram testes estatísticos descreveram os métodos e apresentaram os resultados com uma medida de erro ou variabiliadade. 

Parece que ainda tem muita gente acreditando numa frase atribuída a Rutherford: Se o seu experimento precisa de estatística, você deveria ter feito um experimento melhor.

Relembrem que só estudos dos EEUU e Reino Unido com financiamento público foram incluídos. Temo que o quadro no conjunto total da literatura seja mais desolador. 

Alguém se animou para dar uma olhada nos trabalhos recentes do seu laboratório?  Seria interessante a CEUA promover uma análise semelhante nos trabalhos de cada instituto?

Ilustração.

Kilkenny, C., Parsons, N., Kadyszewski, E., Festing, M., Cuthill, I., Fry, D., Hutton, J., & Altman, D. (2009). Survey of the Quality of Experimental Design, Statistical Analysis and Reporting of Research Using Animals PLoS ONE, 4 (11) DOI: 10.1371/journal.pone.0007824