Células CD8+ na leishmaniose tegumentar humana

Publicações do LIMI 2013

 (aqui)

A protective or deleterious role of CD8+T cells in human cutaneous leishmaniasis (CL) has been debated. The present report explores the participation of CD8+T cells in disease pathogenesis as well as in the parasite killing.
CD8+ T cells accumulated in CL lesions as suggested by a higher frequency of CD8+CD45RO+T cells and CD8+CLA+T cells compared to PBMC. Upon L. braziliensis-restimulation, most of CD8+T cells from the lesion expressed cytolytic markers, CD107a and granzyme B. Granzyme B expression in CL lesions positively correlated with lesion size and percentage of TUNEL-positive cells. We also observed a significant higher percentage of TUNEL-positive cells and granzyme B expression in the biopsies of patients showing a more intense necrotic process.
Furthermore, co-culture of infected macrophages and CD8+T lymphocytes resulted in release of granzyme B and the use of granzyme B inhibitor, as well as z-VAD, Fas:Fc or anti-IFN-γ had no effect upon parasite killing. However, co- culture of infected macrophages with CD4+T cells strongly increased parasite killing, which was completely reversed by anti-IFN-γ. Our results reveal a dichotomy in human cutaneous leishmaniasis: CD8+ Granzyme B+T cells mediate tissue injury whereas CD4+ IFN-γ+T cells mediate parasite killing. 

Qual TLR induz uma resposta Th1 para antígenos amastigota-específicos?

Post de Leonardo Arruda

Um grupo de trabalho da Índia está com um paper no Mol Cell Biochem, no qual identifica quais receptores do tipo Toll (TLR) estariam sendo estimulados por frações do extrato protéico de culturas amastigostas axênicas de L. donovani. 

Para isso, os autores aplicaram o extrato protéico em gel. Após corrida, as proteínas foram divididas em quatro frações de acordo com seu peso molecular. Cada fração foi recuperada isoladamente (Fig 1A).

As frações protéicas foram utilizadas para estimular macrófagos de linhagem e analisar os seguintes parâmetros: Estresse oxidativo, produção de NO, citocinas (IL-12, TNF e IFN-γ) e expressão dos TLRs.

Baseado nos dados obtidos pela estimulação por cada fração, os autores se concentraram na fração Fa, correspondente as proteínas de maior peso molecular. Para isso, aplicaram novo gel apenas com esta fração. Logo, recuperaram frações proteínas com peso molecular mais específico. (Fig 1B)

Os autores concluem o trabalho com a descrição de que duas proteínas deste grupo, uma com 65kDa e outra com 98kDa, quando administradas concomitantemente promovem funções efetoras nos macrófagos.

O que faltou neste trabalho foi a descrição destas proteínas. Entre os métodos para esse fim, seria resolver essas proteínas em gel 2-D, e identificá-las por espectrometria de massa.

Apesar dos autores afirmarem que as duas proteínas quando administradas concomitantemente produzem ação efetora, eles não podem garantir que em sua amostra havia apenas essas duas proteínas. Todas as proteínas de pesos moleculares semelhantes também foram obtidas por esse método. O efeito efetor observado pode ser resultado de antígenos pouco abundantes na amostra. Sendo assim, a identificação destas proteínas, a obtenção de recombinantes e a prova de estimulação, com apenas estas duas proteínas purificadas seria muito mais elegante e útil.

Outro aspecto interessante que não foi abordado seria comparar a estimulação de macrófagos com o extrato protéico de promastigotas. Os autores apenas utilizaram o extrato de amastigotas axênicas, e enriqueceria mais o trabalho verificar se  as faixas protéicas analisadas nas amastigotas também também são expressas e antigênicas em promastigotas. Sendo assim, recomendo a leitura deste paper por abordar um método pouco convencional para identificar grupos de antígenos com atividade imunogênica.

Srivastava A, Singh N, Mishra M, Kumar V, Gour JK, Bajpai S, Singh S, Pandey HP, & Singh RK (2012). Identification of TLR inducing Th1-responsive Leishmania donovani amastigote-specific antigens. Molecular and cellular biochemistry, 359 (1-2), 359-68 PMID: 21858498

Interferons do tipo I e tuberculose

Post de Ricardo Khouri

Publicado originalmente no SBlogI

Mais uma vez, os laços científicos estabelecidos entre o excelente imunologista Dr. Alan Sher e pesquisadores brasileiros trouxeram bons frutos (veja post). Recentemente, a Dra. Lis Antonelli, após um período de dois anos como Visiting Fellow no NIAID Laboratory of Parasitic Diseases, publicou um interessante trabalho sobre o papel dos IFNs do Tipo I (IFN-alfa/beta) endógenos no modelo experimental murino infectado com Mycobacterium (M.) tuberculosis in vivo (Intranasal Poly-IC treatment exacerbates tuberculosis in mice through the pulmonary recruitment of a pathogen-permissive monocyte/macrophage population. J Clin Invest. 2010).

Depois de algumas décadas sendo descritos simplesmente como citocinas antivirais, os IFNs do tipo I (IFN-alpha/beta) ganharam, nos últimos anos, uma atenção considerável como imunomoduladores em doenças infecciosas causadas por agentes como bactérias, fungos e protozoários. No entanto, não há na literatura nenhum papel protetor ou deletério estabelecido nos diferentes modelos experimentais usados para estudar tais doenças infecciosas, apresentando frequentemente efeitos contrastantes quando usados em diferentes doses e/ou regimes de tratamento. 

No estudo realizado por Antonelli et al., camundongos selvagens C57BL/6 foram expostos a concentrações baixas de M. tuberculosis (H37Rv), através de aerosois, e foram tratados por quatro semanas com doses intranasais de Poli ICLC (Poli I:C associado a poli-L-lisina e carboximetilcelulose). O uso de Poli IC associado a poli-L-lisina e carboximetilcelulose prolonga a indução de IFNs do Tipo I in vivo. O tratamento foi iniciado nos grupos animais no primeiro dia (fase aguda) ou no quarto mês após a infecção (fase crônica) e foi capaz de induzir altas concentrações de IFNs do tipo I nos pulmões dos camundongos. O uso do Poli ICLC na fase aguda exacerbou a infecção em 2-log e induziu extensas áreas de necrose nos orgãos pulmonares dos animais. O uso do Poli ICLC na fase crônica da infecção determinou a morte dos animais já no dia 17 após inicio do tratamento. Estes efeitos deletérios não foram observados quando camundongos C57BL/6 depletados do receptor para IFN do tipo I (ifnabr) infectados com M. tuberculosis foram tratados com Poli ICLC.

Interessante, o efeito maléfico do Poli ICLC não estava associado a uma redução na resposta imune do tipo Th1 entre os camundongos tratados ou não. Em ambos os grupos dos camundongos infectados foram detectados as mesmas quantidades de células CD4+CD44+ e CD4+T-bet+ no infiltrado pulmonar e a mesma capacidade dessas células produzirem IFN-gama/TNF-alfa após estimulo in vitro. 

O papel prejudicial dos IFNs do tipo I foi explicado pelo recrutamento preferencial de uma população macrofágica (CD11b+Gr1int) permissiva a infecção por M. tuberculosis. Antonelli et al., mostraram que a indução da expressão de grandes quantidades da quimiocina CCL2 após o tratamento com Poli ICLC atraía os macrófagos CD11b+Gr1int para o sítio da infecção. Ademais, a permissividade dessas células foi exacerbada pelo tratamento com IFNs do tipo I exógeno in vitro reduzindo a expressão de MHC II e aumentando significativamente a carga parasitária nestes macrófagos.

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho, os efeitos deletérios dos IFNs do tipo I, já foram mostrados anteriomente no modelo experimental de leishmaniose humana. Nosso grupo demonstrou que o IFN-beta exógeno era capaz de induzir um aumento significante da carga parasitária dos macrófagos infectados in vitro (Khouri et al., 2009; www.jimmunol.org/cgi/doi/10.4049/jimmunol.0802860). Este aumento foi reflexo da redução na geração de superóxido pelos macrófagos tratados, causado pelo aumento da indução da enzima antioxidante superóxido dismutase 1 (SOD1). 

Assim, a inibição da atividade leishmanicida e bactericida de macrófagos humanos in vitro revela uma semelhança notável do IFN tipo I com o TGF-β, a principal citocina responsável pela desativação de macrófagos. Dessa maneira, os resultados deste trabalho alertam para o uso de adjuvantes para potencialização dos efeitos protetores de vacinas contra microorganismos intracelulares. Como sabemos, muitos dos adjuvantes, assim como o Poli ICLC, utilizam os PRRs (Pathogens Recognition Receptors) para induzir sua ação imunomoduladora e produzir entre muitos fatores, IFNs do tipo I (veja o post Janeway e os PRRs).

Antonelli, L., Gigliotti Rothfuchs, A., Gonçalves, R., Roffê, E., Cheever, A., Bafica, A., Salazar, A., Feng, C., & Sher, A. (2010). Intranasal Poly-IC treatment exacerbates tuberculosis in mice through the pulmonary recruitment of a pathogen-permissive monocyte/macrophage population Journal of Clinical Investigation DOI: 10.1172/JCI40817