Induction of Inflammasome-dependent Pyroptosis by Carbon Black Nanoparticles

Post de Diego Moura Santos (LIP-CPqGM/FIOCRUZ)

Desde meados do século XVIII, com o surgimento da Revolução Industrial na Inglaterra, a poluição passou a constituir um problema de saúde pública. A fuligem – carbono negro (CB) – é um dos produtos formados durante a combustão parcial de combustíveis fósseis. Ele é utilizado no processo de vulcanização de borrachas, como também na produção de tintas, toners para impressoras e produtos cosméticos. Nas grandes cidades, a inalação das nanopartículas de CB está diretamente relacionada com problemas respiratórios. A recente expansão da indústria de nanotecnologia, assim como o crescimento contínuo dos poluentes derivados de carbono, torna imperativa a investigação dos efeitos destes materiais na saúde. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi examinar o efeito das nanopartículas de CB (NP-CB) na indução do inflamassoma e piroptose em macrófagos de linhagem e alveolares.

Primeiramente, os autores mostraram que os macrófagos de linhagem tratados com NP-CB apresentaram uma perda da integridade da membrana plasmática, levando a morte celular. Apesar do rompimento de parte da membrana, as células que fagocitaram as NP-CB possuíam um maior volume, sugerindo que a morte destas células é por piroptose. O próximo passo foi avaliar se exposição a NP-CB é capaz de ativar o inflamassoma, o qual possui um papel central na piroptose. Nas células de linhagem tratadas com NP-CB foi detectada a presença de caspase-1 ativa, tanto no lisado total quanto no sobrenadante, o que indica ativação do inflamassoma, pois trabalhos recentes definiram que a liberação de caspase-1 ativa é uma medida válida da atividade do inflamassoma. O mesmo resultado foi encontrado nos macrófagos alveolares de humanos. Para confirmar a ativação da caspase-1, os autores dosaram a produção de IL-1β, e esta estava aumentada nas células primadas com LPS e tratadas com NP-CB. Para provar que a produção de IL-1β nos macrófagos tratados com NP-CB foi devido à ativação da caspase-1, um grupo experimental foi tratado com o inibidor desta caspase, o YVAD. Como demonstrado no trabalho, as células tratadas com LPS+YVAD+ NP de CB apresentaram uma redução na produção da IL-1 β.

A morte celular por apoptose é caracterizada pela ativação das caspases 2, 3, 6, 7, 8, 9 e 10, diminuição do tamanho celular, formação de corpos apoptóticos e inibição da inflamação. Para demonstrar que a morte celular induzida pelo tratamento das células com NP-CB não é via apoptose, os autores analisaram a ativação das caspases 3 e 9; como controle positivo foi utilizado o “Staurosporine” que é um indutor de apoptose. Somente nos macrófagos tratados com o indutor de apoptose foi detectado a ativação das caspases 3 e 9. Diferente de muitas caspases, a ativação da caspase-1 em macrófagos direciona para uma forma de morte celular conhecida como piroptose. Para confirmar que a morte celular induzida pelas NP-CB é via piroptose, foi avaliado o efeito da inibição da caspase-1 por YVAD e da piroptose por glicina em células tratadas com NP-CB. Utilizando o LDH como marcador de integridade de membrana, foi demonstrado que as células expostas as NP-CB na presença de ambos inibidores apresentaram níveis de LDH similares aos controles.

Como conclusão, o trabalho demonstra claramente que as NP-CB induzem a morte celular via piroptose devido o aumento do volume celular – o oposto da condensação celular associada com apoptose; além da ativação do inflamassoma, como caracterizado pela produção de caspase-1 e IL-1β. O bloqueio da ativação da caspase-1 protegeu os macrófagos da morte.

Reisetter AC, Stebounova LV, Baltrusaitis J, Powers L, Gupta A, Grassian VH, & Monick MM (2011). Induction of inflammasome dependent pyroptosis by carbon black nanoparticles. The Journal of biological chemistry PMID: 21525001

Congresso da SBI 2011

Ensaio randomizado da vacinação BCG em recém-nascidos com baixo peso: efeitos inespecíficos benéficos no período neonatal?

Post de Evelin Oliveira

Nos países em desenvolvimento existe alto índice de mortalidade em crianças recém-nascidas com baixo peso e alguns estudos mostram um efeito benéfico não específico da vacinação com BCG na sobrevivência dos neonatos. A vacina BCG tem o uso recomendado após o nascimento exceto nas crianças com baixo peso que têm a vacinação adiada. Roth e colaboradores (1) mostraram que a vacinação após o nascimento nas crianças com baixo peso diminuiu os níveis de mortalidade em 57%. Pensando nisso, Benn e colaboradores (2) testaram os efeitos da vacinação e revacinação com BCG na sobrevivência das crianças de Guinea-Bissau que apresentaram baixo peso ao nascer e partiram da hipótese de redução da mortalidade em 25%.

Os recém-nascidos selecionados para o estudo apresentaram peso inferior a 2,5kg, sendo que 1182 receberam a BCG logo após o nascimento e 1161 posteriormente. Um dado importante desse estudo foi que a administração da BCG nas crianças com baixo peso foi segura e nenhuma criança desenvolveu doença causada pela bactéria vacinal atenuada. Os pesquisadores mostraram redução de 17% da mortalidade infantil nas crianças com baixo peso vacinadas com BCG quando comparadas com controles não vacinados, o que não foi significativo e não atingiu os valores inicialmente hipotetizados. A redução da mortalidade neonatal foi relacionada ao menor índice de sepse neonatal e infecções respiratórias. A BCG teve um efeito benéfico significativo na mortalidade infantil apenas entre crianças com peso inferior a 1,5kg.





Estudos semelhantes mostraram mais efeitos benéficos nas meninas do que nos meninos (3,4). A vacinação com BCG pode apresentar aumento inespecífico da proteção contra infecções nos neonatos a diversos patógenos não relacionados, como se a vacina estimulasse o sistema imune a montar resposta contra as infecções (5-7). Esses estudos são importantes quando pensamos em políticas de vacinação eficientes, principalmente levando em consideração as regiões em que as medidas adotadas podem fazer a diferença na longevidade da criança. Em algumas regiões da África, a vacinação com BCG é realizada após um mês de vida da criança. Se esses resultados forem consistentes, a vacinação logo após o nascimento pode ajudar a combater infecções micobacterianas e inespecíficas de forma mais eficaz.


Referências:

1.Roth A, Jensen H, Garly ML, et al. Should low birth weight infants receive BCG vaccination at birth? Community study from Guinea- Bissau. PIDJ 2004; 23:544–50.
2. Aaby, P., Roth, A., Ravn, H., Napirna, B., Rodrigues, A., Lisse, I., Stensballe, L., Diness, B., Lausch, K., Lund, N., Biering-Sorensen, S., Whittle, H., & Benn, C. (2011). Randomized Trial of BCG Vaccination at Birth to Low-Birth-Weight Children: Beneficial Nonspecific Effects in the Neonatal Period? Journal of Infectious Diseases, 204 (2), 245-252 DOI: 10.1093/infdis/jir240
3. Roth A, Sodemann M, Jensen H, et al. Tuberculin reaction, BCG scar and lower female mortality. Epidemiology 2006; 17:562–8.
4. Roth AE, Garly ML, Jensen H, Nielsen J, Aaby P. Bacille Calmette Guerin vaccination and infant mortality. Expert Rev Vaccines 2006; 5:277–93.
5. MathurinKS, MartensGW, KornfeldH,WelshRM. CD4T-cell-mediated heterologous immunity between mycobacteria and poxviruses. J Virol 2009; 83:3528–39.
6. Clark IA, Allison AC, Cox FE. Protection of mice against Babesia and Plasmodium with BCG. Nature 1976; 259:309–11.
7. Lalor MK, Ben-Smith A, Gorak-Stolinska P, et al. Population differences in immune responses to Bacille Calmette-Gue´rin vaccination in infancy. J Infect Dis 2009; 199:795–800.

Poros de perfurina na membrana endossomal desencadeiam a liberação da granzima B endocitada para o citosol de células-alvo

Post de Claire Santos

A principal via usada por linfócitos T citotóxicos e células natural killer para eliminar células patogênicas é a exocitose de grânulos, principalmente granzimas, nas sinapses imunes formadas com a célula alvo. As granzimas induzem a morte celular programada através de mecanismos dependente e independente de caspases. No entanto, ainda permanece sem explicação como essas granzimas são liberadas no citosol das células.

Três modelos são propostos na literatura. O primeiro propõe que as granzimas sejam liberadas diretamente no citosol através de poros formados na membrana plasmática pela perforina. O segundo modelo propõe que as granzimas sejam endocitadas independentemente da perforina e que esta atua apenas como um agente endossomolítico. Atualmente, foi proposto um modelo híbrido onde os poros formados na membrana plasmática pela perforina induzem um influxo de Ca+2, o que ativa os mecanismos de reparo da membrana. Nesse modelo, tanto as granzimas como a perforina são co-endocitadas por endossomas gigantes, chamados de gigantossomas.

No trabalho em destaque, os autores investigam como esses gigantossomas são formados e como as granzimas são liberadas dele. Eles observaram que a formação dos gigantossomas é dependente de Rab5, uma GTPase que regula a fusão das vesículas endocitadas com os endossomas iniciais. No entanto a formação desses gigantossomas não é essencial para induzir a morte celular, o que sugere a presença de pequenos endossomas contendo granzima e perforina. A formação de poros pela perforina é severamente comprometida em pH ácido, e os autores observaram que a perforina inibe a acidificação dos endossomas iniciais através da formação de poros na membrana desses endossomas o que interfere com a manutenção do gradiente de pH. Foi demonstrado também a existência de dois tipos diferentes de poros na membrana do endossoma, um pequeno formado por 7 unidades de perforina e outro maior, de tamanho não determinado. Os autores também mostraram que a liberação da granzima presente no endossoma para o citosol é feita em aproximadamente 15 minutos e que a ruptura da membrana do gigantossoma ocorre em aproximadamente 17 minutos ocasionando uma completa liberação da carga presente no endossoma para o citosol.

Esses resultados sugerem que a perforina induz a liberação da granzima no citosol da célula alvo por um processo que envolve duas etapas, a formação de poros na membrana da célula alvo induzindo a endocitose da granzima e da perforina e posteriormente a perforina induz a formação de poros estáveis na membrana do endossoma o que permite a liberação da granzima para o citosol.


Referências:

Thiery, J., Keefe, D., Boulant, S., Boucrot, E., Walch, M., Martinvalet, D., Goping, I., Bleackley, R., Kirchhausen, T., & Lieberman, J. (2011). Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells Nature Immunology DOI: 10.1038/ni.2050

Pipkin ME, Lieberman J. Delivering the kiss of death: progress on understanding how perforin works. Curr Opin Immunol. 2007 Jun;19(3):301-8. Epub 2007 Apr 12. PMID:17433871

Macrófagos com inclusões lipídicas fornecem um ambiente ideal para a latência de Mycobacterium tuberculosis

Post de Theolis Bessa

Pouco se sabe acerca dos mecanismos envolvidos na entrada em latência deste bacilo que infecta silenciosamente um terço da população mundial, e é responsável pela morte de quase dois milhões de pessoas por ano em todo o mundo. A infecção por M. tuberculosis apresenta uma eficiência impressionante: 1-10 bacilos são capazes de estabelecer a infecção nos pulmões de um indivíduo exposto aos aerossóis produzidos pela tosse de um paciente com a forma pulmonar da tuberculose. Apenas 15-20% dos indivíduos desenvolve a tuberculose imediatamente após a infecção inicial; a grande maioria dos indivíduos permanecerá infectada por toda a vida sem manifestar a doença (tuberculose latente) e 10% apresentarão a doença por reativação após um período variável de latência [1].

O artigo de Daniel e colaboradores [2] explora o fato de que o acúmulo de tracilglicerol (TAG), que ocorre para prover uma fonte de reserva energética em vários organismos durante e após a latência/hibernação, foi observado em isolados clínicos de M. tuberculosis e em macrófagos humanos cultivados sob hipóxia, em condições que mimetizariam as encontradas no granuloma (1% O2). Os autores demonstram que macrófagos infectados com M. tuberculosis mantidos sob hipóxia acumulam TAG que depois é metabolizado e seus ácidos graxos são incorporados a vários lipídeos micobacterianos (TAG, lipídeos polares, ésteres de ceras) dentro da bactéria, em um processo que envolve em grande parte a atividade da principal enzima envolvida na síntese de triacilglicerol em micobactérias, a triacilglicerol sintase 1 (ts1). Em macrófagos infectados sob condições de hipóxia as micobactérias apresentaram várias características associadas à latência, como replicação diminuída, indução da expressão de genes associados ao metabolismo lipídico, stress e dormência, resistência à rifampicina e isoniazida, diminuição da proporção de células coráveis por Auramina-O e aumento da proporção de células coráveis por Nile Red, o que não foi observado em bacilos provenientes de culturas de macrófagos infectados mantidos sob normóxia.

Os achados contribuem para a compreensão dos mecanismos que permitem a sobrevivência do M. tuberculosis no indivíduo infectado e amplia as perspectivas para a investigação de drogas capazes de agir sobre o bacilo no estágio de latência, o que permitiria a profilaxia da doença e o controle da transmissão para outros hospedeiros.

Referências:

[1] S.H.E. Kaufmann, Future Vaccination Strategies against Tuberculosis: Thinking outside the Box, Immunity. 33 (2010) 567-577.

[2] Daniel, J., Maamar, H., Deb, C., Sirakova, T., & Kolattukudy, P. (2011). Mycobacterium tuberculosis Uses Host Triacylglycerol to Accumulate Lipid Droplets and Acquires a Dormancy-Like Phenotype in Lipid-Loaded Macrophages PLoS Pathogens, 7 (6) DOI: 10.1371/journal.ppat.1002093