Parker H, Albrett AM, Kettle AJ, & Winterbourn CC (2011). Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of leukocyte biology PMID: 22131345
Neutrófilos formam a primeira linha de defesa contra a invasão de patógenos e, tem sido reportado serem capazes de liberar neutrophil extracellular traps (NETs). NETs são liberados por PMNs em resposta a uma variedade de estímulos e são formados por uma rede fibrosa que serve de armadilha para microorganismos. São consistidos de cromatina nuclear (DNA e histonas) que formam uma rede contendo também proteínas. Muitas destas proteínas se originam de grânulos neutrofílicos que incluem MPO, elastase e peptídeos anti-microbiais. Para que haja a formação da NET é necessária a descondensação do material nuclear, desintegração nuclear e constituintes da membrana e, então, a liberação da cromatina associado à proteínas. NETs podem ser induzidas por uma variedade de mediadores inflamatórios, incluindo PMA, IL-8, anticorpos citoplasmáticos anti-neutrofílicos, plaquetas ativadas por endotoxinas, em pacientes com sepsis e por patógenos como Staphylococcus aureus, Aspergillus fumigatus, Mycobacterium tuberculosis e Candida albicans.
Muitos estímulos que induzem a formação de NETs também ativam a NADPH oxidase neutrofílica a produzir superóxido. Além disso, pacientes com a doença granulomatosa crônica, que possui carência de atividade da NADPH oxidase, não formam NETs em resposta a PMA. Também foi observada liberação de NETs em resposta ao peróxido de hidrogênio (H2O2) exógeno. Entretanto, apenas a exposição à oxidantes não é suficiente, é também necessária a indução de autofagia para formação de NETs. Sabe-se que a mieloperoxidase (MPO) reage com H2O2 e íons para gerar HOCl e, recentemente, foi observado que a MPO também faz parte da constituição das NETs.
Com o objetivo de investigar a importância da MPO para formação da NET e para sua atividade microbicida, foi observado, por microscopia de fluorescência, a liberação de NET pelos PMNs do sangue de indivíduos saudáveis e a aderência de MPO na NET. Posteriormente, PMNs foram tratados com PMA, para indução de NET e foram incubados na presença ou não de DNAse. Após a obtenção do sobrenadante, a atividade da MPO livre foi mensurada. Observou-se uma maior porcentagem de MPO livre na presença da DNAse, enquanto que o mesmo não foi visto na sua ausência, indicando que a MPO associa-se às NETs. E esta associação foi identificada a partir de 2 horas. Para avaliar se a MPO está ativa enquanto está associada à NET, estas foram submetidas à digestão limitada com DNAse. A atividade da MPO associada ao DNA parcialmente digerido foi igual à amostra tratada com alta concentração de DNAse, usada para completa digestão, sugerindo que MPO associado à NET apresenta atividade assim como a MPO livre. A heparina é carregada negativamente e capaz de dissociar a MPO carregada positivamente. Para determinar se heparina poderia desfazer a associação da MPO com a NET (DNA) negativamente carregada, efeitos dos tratamentos com DNAse e heparina foram comparados. O tratamento com heparina durante a formação da NET mostrou uma grande quantidade de MPO livre equivalente ao tratamento com DNAse, indicando que a heparina inibiu a ligação da MPO à NET. Assim, a diferença entre as cargas da MPO e do DNA podem estar relacionadas com a sua associação. Por último, estudos foram feitos com S. aureus para avaliar a capacidade da NET de matar o patógeno. Após indução de NET, a MPO livre foi cuidadosamente retirada para que permanecessem apenas MPO associado à NET e H2O2 foi adicionado como substrato para MPO. Nessas condições, houve a redução da viabilidade da bactéria, e esta redução foi dose-dependente de H2O2, enquanto que na sua ausência não houve morte do patógeno, indicando a importância da presença de H2O2 para a atividade de MPO. Além disso, a morte das bactérias foi prevenida pela presença de inibidor de MPO, indicando que a morte do patógeno é dependente de MPO.
Com este trabalho, pode-se concluir que há a presença enzimaticamente ativa da MPO em quantidades substanciais nas NETs e a atividade da MPO é importante para o mecanismo microbicida da NET.
Muitos estímulos que induzem a formação de NETs também ativam a NADPH oxidase neutrofílica a produzir superóxido. Além disso, pacientes com a doença granulomatosa crônica, que possui carência de atividade da NADPH oxidase, não formam NETs em resposta a PMA. Também foi observada liberação de NETs em resposta ao peróxido de hidrogênio (H2O2) exógeno. Entretanto, apenas a exposição à oxidantes não é suficiente, é também necessária a indução de autofagia para formação de NETs. Sabe-se que a mieloperoxidase (MPO) reage com H2O2 e íons para gerar HOCl e, recentemente, foi observado que a MPO também faz parte da constituição das NETs.
Com o objetivo de investigar a importância da MPO para formação da NET e para sua atividade microbicida, foi observado, por microscopia de fluorescência, a liberação de NET pelos PMNs do sangue de indivíduos saudáveis e a aderência de MPO na NET. Posteriormente, PMNs foram tratados com PMA, para indução de NET e foram incubados na presença ou não de DNAse. Após a obtenção do sobrenadante, a atividade da MPO livre foi mensurada. Observou-se uma maior porcentagem de MPO livre na presença da DNAse, enquanto que o mesmo não foi visto na sua ausência, indicando que a MPO associa-se às NETs. E esta associação foi identificada a partir de 2 horas. Para avaliar se a MPO está ativa enquanto está associada à NET, estas foram submetidas à digestão limitada com DNAse. A atividade da MPO associada ao DNA parcialmente digerido foi igual à amostra tratada com alta concentração de DNAse, usada para completa digestão, sugerindo que MPO associado à NET apresenta atividade assim como a MPO livre. A heparina é carregada negativamente e capaz de dissociar a MPO carregada positivamente. Para determinar se heparina poderia desfazer a associação da MPO com a NET (DNA) negativamente carregada, efeitos dos tratamentos com DNAse e heparina foram comparados. O tratamento com heparina durante a formação da NET mostrou uma grande quantidade de MPO livre equivalente ao tratamento com DNAse, indicando que a heparina inibiu a ligação da MPO à NET. Assim, a diferença entre as cargas da MPO e do DNA podem estar relacionadas com a sua associação. Por último, estudos foram feitos com S. aureus para avaliar a capacidade da NET de matar o patógeno. Após indução de NET, a MPO livre foi cuidadosamente retirada para que permanecessem apenas MPO associado à NET e H2O2 foi adicionado como substrato para MPO. Nessas condições, houve a redução da viabilidade da bactéria, e esta redução foi dose-dependente de H2O2, enquanto que na sua ausência não houve morte do patógeno, indicando a importância da presença de H2O2 para a atividade de MPO. Além disso, a morte das bactérias foi prevenida pela presença de inibidor de MPO, indicando que a morte do patógeno é dependente de MPO.
Com este trabalho, pode-se concluir que há a presença enzimaticamente ativa da MPO em quantidades substanciais nas NETs e a atividade da MPO é importante para o mecanismo microbicida da NET.
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