Citometria de fluxo para avaliar infecção por esporozoítos de Plasmodium falciparum

Post de Gabriela B. C. Garcia

A malaria resulta, anualmente, em 800.000 mortes em todo o mundo (Snow et al, 2005). A infecção sintomática pelo Plasmodium só é detectada quando os merozoítos infectam as hemácias, após a reprodução dos esporozoítos nos hepatócitos (Vaughan et al, 2008). O desenvolvimento de mecanismos que interfiram na infecção pré-eritrocítica é fundamental, visto a ausência de sintomas clínicos no estágio hepático da doença. 

Ensaios para mensurar a inibição da infecção pré-clínica são datados da década de 1980 e basearam-se em microscopia. Em busca de mecanismos que possam monitorar quantitativamente as taxas de invasão e inibição, Kaushansky et al (2012) propuseram um teste por citometria de fluxo. Este teste é capaz de avaliar a inibição da infecção por drogas e a eficácia de anticorpos no bloqueio da invasão.  A necessidade de monitoramento deve-se à ausência de uma droga que bloqueie o esporozoíto, e ao fato de que ensaios (ELISA) com a vacina mais eficaz contra a malária clínica (50% de eficácia, segundo Agnandji et al, 2011) não demonstraram a relação entre a proteção e a funcionalidade das respostas dos anticorpos. 

Basicamente três testes são utilizados para a avaliação da infecção por esporozoítos (Ver tabela).

Devido às limitações de rendimento dos ensaios disponíveis, foi desenvolvida a técnica de monitoramento por citometria de fluxo.  Neste experimento, foram cultivados hepatócitos HC04 que, de acordo com Karnasuta et al (1995), suportam invasão e desenvolvimento de P. falciparum  in vitro. Em seguida, estas células foram infectadas com esporozoítos e incubadas durante 90 min. Após este tempo, as células foram separadas, fixadas e permeabilizadas, posteriormente coradas com um anticorpo monoclonal (2A10) para a circumsporozoite protein (CSP) do P.  falciparum.  A análise fundamentou-se na percentagem de hepatócitos que foram infectados pelos parasitas e na identificação de hepatócitos com altos níveis de CSP (Fig 1A-B). 

A capacidade dessa técnica para monitorizar a inibição do esporozoíto pela droga também foi avaliada. Os esporozoítos foram tratados com Citocalasina D, molécula capaz de inibir a polimerização da actina do parasita, o que ocasionou acentuada diminuição da capacidade de invasão celular (Fig 1D).

Esporozoítos foram incubados sem ou com quatro concentrações diferentes de anticorpo monoclonal purificado para CSP. Esse procedimento permitiu a caracterização das taxas de invasão devido ao bloqueio por anticorpos. A invasão pelos esporozoítos foi inibida de acordo com a concentração do anticorpo (Fig 1E-G). 

O estudo em questão apresentou o desenvolvimento de uma metodologia eficiente, quantitativa e imparcial para a monitoração da invasão de esporozoítos de P. falciparum.  Esta técnica contribui para o desenvolvimento de possíveis fármacos capazes de impedir a infecção pré-eritrocítica, assim como auxilia na elucidação de respostas de anticorpos funcionais em abordagens clínicas. 

Kaushansky, A., Rezakhani, N., Mann, H., & Kappe, S. (2012). Development of a quantitative flow cytometry-based assay to assess infection by Plasmodium falciparum sporozoites Molecular and Biochemical Parasitology, 183 (1), 100-103 DOI: 10.1016/j.molbiopara.2012.01.006

A tristeza é uma “infecção” social?

Todo mundo já ouviu falar que a alegria é contagiosa. Lógico que há vários fatores responsáveis pela alegria, melancolia, tristeza e outros sentimentos, mas há base para a afirmativa que a tristeza ou alegria têm uma transmissão como as doenças infecciosas? Algumas tentativas neste sentido foram feitas, mas não demonstraram claramente a hipótese.

A população humana se distribui em redes sociais as quais determinam interações e influenciam  no padrão de distribuição de doenças, mas também em muitos aspectos da vida, como as idéias e os comportamentos. Em julho de 2010, o Proceedings of the Royal Society B, publicou o trabalho “Emotions as infectious diseases in a large social network: the SISa model” (doi: 10.1098/rspb.2010.1217) que avaliou o padrão de transmissão de estados emocionais de longa duração numa rede social. Os autores analisaram dados do Framingham Heart Study, um projeto de estudo em cardiologia que coleta dados sociais e de saúde da população da cidade de Framingham, Massachusetts, desde 1948. Eles comparam o padrão de relacionamento e de emoções da população estudada com modelos desenvolvidos para o estudo de contágio em doenças infecciosas. Os dados foram analisados segundo o modelo susceptível-infectado-susceptível (SIS) mas incluía a possibilidade de infecção automática (espontânea) no modelo (SISa). Também foram “descontadas” as emoções compartilhadas imediatamente, como a de parentes e amigos que passam pela mesma experiência. Desta maneira, o foco ficava nas alterações emocionais que eram seguidas por mudanças em outros indivíduos.

Os dados mostram que os estados emocionais se comportam como doenças infecciosas, se espalhando em redes sociais em longos períodos de tempo. As alterações emocionais se distribuem em clusters, um padrão característico de processos infecciosos. No caso de alegria, os clusters obedeciam exatamente o esperado para doenças infecciosas, já para a tristeza os clusters foram maiores que o esperado, sugerindo a existência de algum outro efeito.

A probabilidade de se tornar contente aumenta 0,02 por ano para cada contato e a probabilidade de ficar descontente aumenta de 0,04 por ano por contato. Não é pouco! 

Cada amigo feliz aumenta a sua chance individual de ficar feliz em 11%, parecido com o que acontece numa epidemia de gripe. Quanto mais amigos com gripe, maior a sua chance de ter gripe. O outro lado também é verdadeiro, cada amigo triste, DOBRA a sua chance de ficar infeliz.  O que equilibra um pouco é que o tempo de duração de uma “infecção” de contentamento foi de 10 anos e de uma infecção de descontentamento de 5 anos.

Claro que estes modelos e cálculos precisam ser validados em outros estudos. Além disto, este  estudo o estudo base (Framingham) não é dirigido para aspectos emocionais, pelo que futuros estudos planejados para testar esta hipótese poderão ser mais informativos.

Outro aspecto a destacar é a limitação de conclusões válidas numa dinâmica ampla para a tomada de decisões individuais. Resta por demonstrar que a modelagem proposta é capaz de prever futuros eventos a ocorrer na coorte do Framingham.

Alguns aspectos práticos:

• é bastante possível que este padrão de “contágio” interpessoal exista também em aspectos como comportamento e idéias, o que pode ser aplicado para entender vários campos, como a política;
• mesmo que este padrão de disseminação da tristeza seja válido num plano pessoal, não é ético, nem socialmente aceitável, se afastar dos seus amigos tristes, por razões “higiênicas”.

Hill, A., Rand, D., Nowak, M., & Christakis, N. (2010). Emotions as infectious diseases in a large social network: the SISa model Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences DOI: 10.1098/rspb.2010.1217

Ilustração.

Bases moleculares de infecções crônicas por Pseudomonas aeruginosa em pacientes com fibrose cística

Post de Lucas Nogueira

Pesquisadores do Biozentrum (Basel, Suíça) identificaram pequenas colônias variantes (SCV, ‘Small Colony Variants”) de Pseudomonas aeruginosa como sendo característico de infecções crônicas em pacientes com fibrose cística. A pesquisa sugere que o aparecimento dessas colônias na fase crônica da doença poderia ser um alvo para o desenvolvimento de fármacos antimicrobianos. Os resultados da pesquisa foram publicados no periódico PLoS Pathogens  em 10 de Março de 2010.

A fibrose cística é uma doença de base genética. O prognóstico é agravado quando ocorre comprometimento do sistema respiratório associado a infecções crônicas por patógenos oportunistas. Tais infecções ocorrem principalmente pela bactéria P. aeruginosa e são a principal causa de mortalidade e morbidade em pacientes com fibrose cística. Para piorar o quadro, estas infecções crônicas constituem um sério problema de saúde pública, uma vez que a detecção de SCV se correlaciona com a resistência ao tratamento com antibióticos. 

Neste estudo, Jake Malone e Urs Jenal caracterizaram um sistema de sinalização em P. aeruginosa denominado YfiBNR. Mutações nesse locus genético promovem o aparecimento de SCV. Foi observado que a ativação de YfiBNR resulta no aumento da molécula de sinalização c-di-GMP (“cyclic-di-guanosine monophosphate”), o que, por sua vez, leva a uma maior produção de exopolissacarídeos e  redução na taxa de crescimento da bactéria, dois fenótipos característicos  de SCV isoladas de pacientes com fibrose cística. Os autores demonstraram ainda que bactérias mutantes para o gene YfiR (Delta-YfiR) apresentam o fenótipo de SCV, altos níveis de c-di-GMP e são mais resistentes à fagocitose mediada por macrófagos, o que poderia ser um mecanismo de escape do sistema imune relacionado à cronicidade da infecção. Adicionalmente, bactérias Delta-YfiR são mais persistentes em camundongos infectados. Dessa forma, os pesquisadores sugerem que a c-di-GMP pode ser uma molécula importante para o desenvolvimento de infecções crônicas por bactérias patogênicas.

Ilustração: P. aeruginosa Delta-YfiR (verde) são mais resistentes à fagocitose mediada por macrófagos (em vermelho; núcleo da célula em azul).

Malone, J., Jaeger, T., Spangler, C., Ritz, D., Spang, A., Arrieumerlou, C., Kaever, V., Landmann, R., & Jenal, U. (2010). YfiBNR Mediates Cyclic di-GMP Dependent Small Colony Variant Formation and Persistence in Pseudomonas aeruginosa PLoS Pathogens, 6 (3) DOI: 10.1371/journal.ppat.1000804

Demência e inflamação

Um estudo do Journal of Experimental Medicine de janeiro propõe um mecanismo entre a demência e a inflamação.  O processo inflamatório tem recebido bastante atenção pois está envolvido em diversos processos nos quais não se suspeitava de sua participação. Há já algum tempo, chamou atenção que a úlcera péptica tivesse uma etiologia infecciosa. Esta descoberta resultou na concessão do Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 2005 a Barry J. Marshall e J. Robin Warren por sua descoberta do Helicobacter pylori e seu papel na gastrite e na úlcera péptica.

No mesmo passo, a aterosclerose, considerada como uma doença depósito de gordura, hoje é vista como resultante de inflamação. Uma revisão de Göran K. Hansson, na New England Journal of Medicine, se inicia com: “Recent research has shown that inflammation plays a key role in coronary artery disease (CAD) and other manifestations of atherosclerosis. Immune cells dominate early atherosclerotic lesions, their effector molecules accelerate progression of the lesions, and activation of inflammation can elicit acute coronary syndromes.” 

Há alguns anos a relação entre inflamação e demência tem sido investigada, havendo inclusive dados epidemiológicos a este respeito.
O estudo recente do JEM relaciona a progranulina com a demência e falha nos mecanismos de defesa contra infecção. A progranulina está envolvida na supressão da inflamação, na cicatrização de lesões, desenvolvimento embrionário e tumorigênese. Mutações que levam à expressão reduzida de progranulina causam demencia frontotemporal no homem.
O estudo  de Yin e cols, mostra que a progranulina previne a lesão das células do sistema nervoso.

"To explore the role of PGRN in vivo, we generated PGRN-deficient mice. Macrophages from these mice released less interleukin-10 and more inflammatory cytokines than wild type (WT) when exposed to bacterial lipopolysaccharide. PGRN-deficient mice failed to clear Listeria monocytogenes infection as quickly as WT and allowed bacteria to proliferate in the brain, with correspondingly greater inflammation than in WT. PGRN-deficient macrophages and microglia were cytotoxic to hippocampal cells in vitro, and PGRN-deficient hippocampal slices were hypersusceptible to deprivation of oxygen and glucose. With age, brains of PGRN-deficient mice displayed greater activation of microglia and astrocytes than WT, and their hippocampal and thalamic neurons accumulated cytosolic phosphorylated transactivation response element DNA binding protein–43. Thus, PGRN is a key regulator of inflammation and plays critical roles in both host defense and neuronal integrity. FTD associated with PGRN insufficiency may result from many years of reduced neutrotrophic support together with cumulative damage in association with dysregulated inflammation."

A resposta inflamatória exagerada das células da micróglia ativada nos camundongos deficientes de progranulina levou a um aumento do dano e morte neuronal.

Os camundongos deficientes em progranulina não têm todos as características da demência frontotemporal e nem tudo que se observa em camundongos pode se transpor para o homem, mas o estudo abre perspectivas interessantes para o estudo da demência no homem.


Yin, F., Banerjee, R., Thomas, B., Zhou, P., Qian, L., Jia, T., Ma, X., Ma, Y., Iadecola, C., Beal, M., Nathan, C., & Ding, A. (2009). Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice Journal of Experimental Medicine, 207 (1), 117-128 DOI: 10.1084/jem.20091568