Citometria de fluxo para avaliar infecção por esporozoítos de Plasmodium falciparum

Post de Gabriela B. C. Garcia

A malaria resulta, anualmente, em 800.000 mortes em todo o mundo (Snow et al, 2005). A infecção sintomática pelo Plasmodium só é detectada quando os merozoítos infectam as hemácias, após a reprodução dos esporozoítos nos hepatócitos (Vaughan et al, 2008). O desenvolvimento de mecanismos que interfiram na infecção pré-eritrocítica é fundamental, visto a ausência de sintomas clínicos no estágio hepático da doença. 

Ensaios para mensurar a inibição da infecção pré-clínica são datados da década de 1980 e basearam-se em microscopia. Em busca de mecanismos que possam monitorar quantitativamente as taxas de invasão e inibição, Kaushansky et al (2012) propuseram um teste por citometria de fluxo. Este teste é capaz de avaliar a inibição da infecção por drogas e a eficácia de anticorpos no bloqueio da invasão.  A necessidade de monitoramento deve-se à ausência de uma droga que bloqueie o esporozoíto, e ao fato de que ensaios (ELISA) com a vacina mais eficaz contra a malária clínica (50% de eficácia, segundo Agnandji et al, 2011) não demonstraram a relação entre a proteção e a funcionalidade das respostas dos anticorpos. 

Basicamente três testes são utilizados para a avaliação da infecção por esporozoítos (Ver tabela).

Devido às limitações de rendimento dos ensaios disponíveis, foi desenvolvida a técnica de monitoramento por citometria de fluxo.  Neste experimento, foram cultivados hepatócitos HC04 que, de acordo com Karnasuta et al (1995), suportam invasão e desenvolvimento de P. falciparum  in vitro. Em seguida, estas células foram infectadas com esporozoítos e incubadas durante 90 min. Após este tempo, as células foram separadas, fixadas e permeabilizadas, posteriormente coradas com um anticorpo monoclonal (2A10) para a circumsporozoite protein (CSP) do P.  falciparum.  A análise fundamentou-se na percentagem de hepatócitos que foram infectados pelos parasitas e na identificação de hepatócitos com altos níveis de CSP (Fig 1A-B). 

A capacidade dessa técnica para monitorizar a inibição do esporozoíto pela droga também foi avaliada. Os esporozoítos foram tratados com Citocalasina D, molécula capaz de inibir a polimerização da actina do parasita, o que ocasionou acentuada diminuição da capacidade de invasão celular (Fig 1D).

Esporozoítos foram incubados sem ou com quatro concentrações diferentes de anticorpo monoclonal purificado para CSP. Esse procedimento permitiu a caracterização das taxas de invasão devido ao bloqueio por anticorpos. A invasão pelos esporozoítos foi inibida de acordo com a concentração do anticorpo (Fig 1E-G). 

O estudo em questão apresentou o desenvolvimento de uma metodologia eficiente, quantitativa e imparcial para a monitoração da invasão de esporozoítos de P. falciparum.  Esta técnica contribui para o desenvolvimento de possíveis fármacos capazes de impedir a infecção pré-eritrocítica, assim como auxilia na elucidação de respostas de anticorpos funcionais em abordagens clínicas. 

Kaushansky, A., Rezakhani, N., Mann, H., & Kappe, S. (2012). Development of a quantitative flow cytometry-based assay to assess infection by Plasmodium falciparum sporozoites Molecular and Biochemical Parasitology, 183 (1), 100-103 DOI: 10.1016/j.molbiopara.2012.01.006