Caracterização post mortem de Pacientes com Malária vivax

Post de Gabriela B. C. Garcia

A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (Manaus-AM) registrou, de 1996 a 2010, 19 mortes de pacientes infectados por Plasmodium vivax, espécie mais frequente do parasita da malária na região. Embora ainda considerada benigna, a malária vivax possui taxas de letalidade similares à infecção por P. falciparum e potencial para tornar-se grave, de acordo com estudos recentes. No entanto, os mecanismos clínicos e patológicos que levam à morte são pouco esclarecidos. Neste estudo, Lacerda et al. analisaram as complicações atribuídas à doença com base em 17 autópsias obtidas durante o período de 15 anos. 

Quando em vida, os pacientes foram diagnosticados pelo método da gota espessa e tratados com cloroquina e primaquina. Os pesquisadores utilizaram nested-PCR para eliminar a possibilidade de coinfecção por P.falciparum a partir de DNA extraído de seções parafinizadas do baço e do pulmão, cedidas pelo departamento de patologia. Obtiveram também os prontuários e relatórios de autópsia macroscópica. Ensaios de imuno-histoquímica e imuno-histofluorescência auxiliares foram realizados para identificar comorbidades (dengue, hepatite B, entre outras). 

Após análise das informações clínicas e patológicas obtidas, os casos foram classificados em: 

1. P. vivax como provável causa da morte, quando as alterações clínicas e patológicas fossem peculiares à malária e na ausência de comorbidades;
2. P. vivax contribuiu para a morte, quando o paciente também possuía outra condição clínica crônica ou aguda;
3. P. vivax como um achado incidental, quando a causa da morte pôde ser estabelecida e as alterações clínicas graves não foram associadas à malária.     

A tabela 1, acima, resume os dados clínicos e laboratoriais disponíveis sobre as 17 autópsias realizadas. 

As síndromes clínicas graves mais comuns diagnosticadas antes da morte foram insuficiência respiratória (15 de 17), icterícia (7de 17), insuficiência renal aguda (6 de 17), anemia grave (5 de 17) e coma (3 de 17). Com exceção do paciente 3, todos os demais
cumpriram pelo menos um dos critérios da OMS para a malária grave.

As autópsias confirmam que o P. vivax pode provocar doença fatal na América Latina, pois, em 13 dos 17 pacientes estudados, este parasita foi considerado a causa direta da morte ou contribuiu consideravelmente para a sua ocorrência. A principal complicação em pacientes que morreram devido à malária grave foi a síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) e edema pulmonar associado ao acúmulo de neutrófilos no espaço interalveolar (6 casos). Em seguida, ruptura do baço (3 casos) e síndrome da disfunção de múltiplos órgãos (3 casos). As outras 4 mortes tiveram suas causas bem reconhecidas, tais como pneumonia, meningite ou febre amarela.

A alta prevalência de comorbidades encontrada contribui para um pior prognóstico da doença. Este problema certamente é mais notável em áreas de transmissão instável, onde os adultos mais velhos que sofrem de condições crônicas (p.ex. hipertensão, diabetes ou cirrose) são mais propensos a apresentar malária. 

A morte dos indivíduos com deficiência de G6PD e doença falciforme, distúrbios hereditários que são particularmente frequentes em regiões endêmicas de malária, destaca que a infecção por P. vivax pode ser especialmente prejudicial a estas pessoas. 

Regiões que relatam malária vivax grave são as mesmas que demonstram resistência à cloroquina, de acordo com estudos realizados na Indonésia e no Brasil. Devido a esse fato, segundo a OMS, a malária vivax grave deve ser tratada com derivados de artemisinina. 

Conclui-se que o P. vivax pode exercer forte influência na morte de pacientes com doenças pré-existentes, mas também pode por si só causar a morte, conforme resultados do estudo em referência. A correlação entre a mortalidade associada à malária e a presença de comorbidades indica que estudos sobre as taxas de letalidade devidas à malária devem ser feitos com adequada exclusão de outras condições médicas que possam superestimar o efeito do P. vivax. Portanto, mais estudos com autópsias são necessários e fundamentais para a compreensão das discrepâncias entre a clínica e a patologia da malária vivax grave.  

Referência:

Lacerda MVG, Fragoso SCP, Alecrim MGC, Alexandre MAA, Magalhães BML, Siqueira AM, Ferreira LCL, Araújo JR, Mourão MPG, Ferrer M, Castillo P, Martin-Jaular L, Fernandez-Becerra C, del Portillo H, Ordi J, Alonso PL, Bassat Q. Postmortem Characterization of Patients With Clinical Diagnosis of Plasmodium vivax Malaria: To What Extent Does This Parasite Kill? Clinical Infectious Disease 2012; 55(8):e67-74 DOI 10.1093/cid/cis615

Malaria research State of the Science, por Tony Fauci

Uma excelente revisão de Fauci sobre o estado da pesquisa em malária. Está um pouco antiga (foi feita no final de 2011)

Redes moleculares na malária por Plasmodium vivax

Publicação do LIMI e do LIP sobre redes moleculares em indivíduos infectados por Plasmodium vivax, comparando as relações do sistema imune com outros elementos em diferentes quadros da malária.
Networking the host immune system in Plasmodium vivax malaria.   
Malaria Journal 2013, 12:69. 
doi: 10.1186/1475-2875-12-69  (aqui)

Abstract

Background

Plasmodium vivax malaria clinical outcomes are a consequence of the interaction of multiple parasite, environmental and host factors. The host molecular and genetic determinants driving susceptibility to disease severity in this infection are largely unknown. Here, a network analysis of large-scale data from a significant number of individuals with different clinical presentations of P. vivax malaria was performed in an attempt to identify patterns of association between various candidate biomarkers and the clinical outcomes.

Methods

A retrospective analysis of 530 individuals from the Brazilian Amazon, including P. vivax-infected individuals who developed different clinical outcomes (148 asymptomatic malaria, 187 symptomatic malaria, 13 severe non-lethal malaria, and six severe lethal malaria) as well as 176 non-infected controls, was performed. Plasma levels of liver transaminases, bilirubins, creatinine, fibrinogen, C-reactive protein, superoxide dismutase (SOD)-1, haem oxygenase (HO)-1 and a panel composed by multiple cytokines and chemokines were measured and compared between the different clinical groups using network analysis.

Results

Non-infected individuals displayed several statistically significant interactions in the networks, including associations between the levels of IL-10 and IL-4 with the chemokine CXCL9. Individuals with asymptomatic malaria displayed multiple significant interactions involving IL-4. Subjects with mild or severe non-lethal malaria displayed substantial loss of interactions in the networks and TNF had significant associations more frequently with other parameters. Cases of lethal P. vivaxmalaria infection were associated with significant interactions between TNF ALT, HO-1 and SOD-1.

Conclusions

The findings imply that clinical immunity to P. vivax malaria is associated with multiple significant interactions in the network, mostly involving IL-4, while lethality is linked to a systematic reduction of complexity of these interactions and to an increase in connections between markers linked to haemolysis-induced damage.

Tendencias no Google

É possível fazer comparações de consultas no Google o que pode gerar informações importantes.

O gráfico acima compara as consultas com o termo "leishmaniasis" em azul com "Chagas disease" (vermelho) no mundo todo de 2004 até o presente.

Veja a baixo a comparação entre  "leishmaniasis"em azul com "malaria" com os mesmos parâmetros.

Variações genéticas de TLR-4, TLR-9 e TIRAP em pacientes com malária

TLR e TIRAP na mediação da transcrição de citocinas inflamatórias. 

Por Lígia Correia Lima de Souza

A malária está entre as três principais doenças infecciosas do planeta, no ano de 2010 a incidência foi cerca de 216 milhões de casos e 655.000 mortes. Os casos de malária grave cursam tipicamente com anemia, acidose metabólica, hipóxia, hipoglicemia, acidose lática, hipotensão e por vezes com malária cerebral. Nessa gama de manifestações, mediadores inflamatórios são de ampla importância na manifestação da doença grave. Para deflagrar a produção desses mediadores inflamatórios os TLRs (Toll-like receptors) desempenham um papel importante(ver figura).

Através do reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), os TLRs promovem não somente a produção de citocinas inflamatórias, como também, a migração e maturação de células dendríticas, facilitando a comunicação entre a imunidade inata e a adquirida. A via mediada pelo TLR com produção de citocinas inflamatórias pode ser intensificada ou atenuada por polimorfismos genéticos nesses receptores ou em moléculas associadas. Em humanos TLR2, TLR4 e TLR9 estão envolvidos na resposta contra o plasmódio. Neste sentido, Zakeri et al  (2011) investigou SNPs (Single nucleotide polymorphims) nos genes de TLR4, TLR9 e de TIRAP (uma proteína adaptadora associada com TLR) e os relacionou com o desfecho da infecção por malária leve em uma população iraniana. 

Para isso, estudou-se 640 indivíduos - 320 saudáveis e 320 com malária sintomática. Foram feitos testes de PCR para constatar a infecção por Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum ou coinfecção. Através de PCR seguido por corte com enzima de restrição (método RFLP – restriction fragment lenght polymorphim) e leitura em eletroforese com gel de agarose, bem como por meio de sequenciamento dos genes referidos, os seguintes polimorfismos foram analisados:

• No gene de TLR4 investigou-se D299G e T399I (SNPs que alteram o sítio de ligação do TLR e são correlacionados com malária grave)
• Na região promotora de TLR9 investigou T-1486C e T-1237C (associados com asma e malária placentária respectivamente)
• No gene de TIRAP o SNP S180L foi estudado (relacionado à redução da sinalização de TLR2 e TLR4, e a heterozigose é relacionada à proteção em malária grave e a uma resposta inflamatória moderada).

Entre os indivíduos infectados todos apresentaram monoinfecção por P. falciparum com malária leve. Após a análise dos polimorfismos descritos, não foi encontrada associação entre a distribuição dos alelos dos polimorfismos pesquisados e manifestações clínicas. Em seguida, analisou-se a frequência genotípica, não sendo encontrada associação entre os SNPs de TLR4, ou de TLR9 e as manifestações clínicas de malária leve.  Por outro lado, heterozigose do SNP S180L do gene TIRAP foi mais frequente entre os indivíduos infectados que entre os não infectados (33.8 vs. 25.6; OR, 1.479; 95% CI, 1.051-2.081; P = 0.024).

Em diálogo com outros trabalhos, o estudo de Zakeri et al (2011), ao demonstrar níveis maiores de heterozigose de SNP S180L do gene TIRAP em indivíduos com malária leve, pode ratificar os trabalhos anteriores que associam o papel do SNP S180L com a proteção contra malária grave. Os heterozigotos para esse polimorfismo têm níveis intermediários de ativação das vias de TLR2 e TLR4, apresentando, portanto, uma resposta inflamatória moderada e protetora (com malária leve).

Por fim, entender a relação entre os polimorfismos e a gravidade, suscetibilidade ou resistência à malária é um grande avanço para a elaboração de estratégias terapêuticas e identificação de alvos para vacinas. Contudo, outros estudos em distintas populações são necessários para confirmar a relevância de tais variabilidades genéticas no desfecho clínico da malária e de outras doenças infecciosas.

Sedigheh Zakeri, Sakineh Pirahmadi, Akram A Mehrizi, & Navid D Djadid (2011). Genetic variation of TLR-4, TLR-9 and TIRAP genes in Iranian malaria patients Malaria Journal , 10 DOI: 10.1186/1475-2875-10-77

STEVENSON, M.M., RILEY E.M. Innate Immunity to Malaria. Nature Reviews, Immunology, March 2004 | Volume 4.

WHO, 10 facts on malária disponível em: http://www.who.int/features/factfiles/malaria/en/index .html, acesso em: 01 de set. 2012.

Impacto da Hemólise Intravascular da Malária na Disfunção Hepática

Post de Gabriela B. C. Garcia

A hemólise intravascular, uma condição patológica presente em várias doenças, é uma das grandes manifestações da infecção pela malária. O Plasmodium modifica os eritrócitos e degrada aproximadamente 60 - 80% do total de células vermelhas do sangue. A hemólise grave leva a complicações sistêmicas e a lesões em órgãos-alvo, implicando na patogênese da malária grave.

Em trabalho recentemente publicado, Dey e cols. (2012) fornecem evidências experimentais de que a lesão hepática da malária resulta do acúmulo de heme livre e aumento de oxidantes reativos no fígado, o que favorece a infiltração de neutrófilos. Foi demonstrado que o excesso de heme e o estresse oxidativo atuam na ativação do fator de transcrição NF-kB , responsável em promover a expressão de diversos genes – entre eles ICAM1, VCAM1, CXCL1 (KC), CXCL2 (MIP-2) – que codificam moléculas de adesão ou quimiocinas. Ambas possibilitam a aderência e infiltração de neutrófilos. Durante a hemólise intravascular há liberação de hemoglobina livre. Esta, por não ser captada pela haptoglobina devido à sua indisponibilidade nos eventos graves, é oxidada em ferrihemoglobina e se dissocia em globina e heme livre. O heme livre deveria ser retirado do sangue através da ligação com a hemopexina e posterior endocitose nos hepatócitos. No entanto, a hemopexina similarmente falha no combate ao excesso de heme e sua concentração é aumentada no soro. 

Hemoglobina extracelular e heme livre são muito tóxicos por serem pró-oxidantes. O heme reage com H₂O₂ endógena e produz oxidantes reativos (esta interação também produz ferro pelo heme). Dentro do tecido, a toxicidade do heme é contra-atacada pela degradação desse grupo prostético pela heme-oxigenase 1 (HO-1). A ação da HO-1 sobre o heme também produz ferro, além de biliverdina e CO. Quando liberado, o ferro geralmente é quelatado pela ferritina. Entretanto, devido à condição hemolítica persistente e contínuo suprimento de heme, a HO-1 é superinduzida e gera enormes quantidades de ferro livre. Esta condição pode ultrapassar o limite da capacidade de sequestro do ferro pela ferritina. A falha do sistema citoprotetor ocasiona grave estresse oxidativo e morte celular por necrose e apoptose.  Em síntese, o heme pode ser degradado por HO-1 ou H₂O₂. Isso resultará na geração de ferro livre (Fe⁺²) e, consequentemente, este também produzirá oxidantes reativos. 

Em um dos experimentos realizados, uma sonda fluorescente indicadora de reações redox (DCFDA) sinalizou alterações do ferro livre em hepatócitos isolados do fígado de camundongos infectados. Os dados obtidos indicaram mudanças significativas em reações redox mediadas por ferro livre ou pela presença de radical com um elétron oxidante. As reações oxidativas aumentaram com o progresso da parasitemia ao longo do tempo (vide figura 3). 

Durante a malária são encontrados maiores níveis de TNFα, citocina importante para a infiltração de neutrófilos no fígado e em outros órgãos. O heme também sensibiliza, por meio do estresse oxidativo, as células a terem morte mediada por TNFα. Portanto, propõe-se que sobrecarga de heme no fígado é a causa da grande produção de radicais livres através de reações mediadas por Fe e ação concomitante do TNFα. Foi realizado experimento de neutralização de TNFα e, como resultado, não houve infiltração de neutrófilos no fígado de camundongos com malária. Assim, concluiu-se que o tratamento com anticorpos anti-TNFα previne a infiltração de neutrófilos e dano hepático induzido pela malária. 

Oxidantes reativos podem regular NF-kB de diversas maneiras e TNFα também é capaz de ativá-lo. Este fator de transcrição, quando mal regulado, gera cascatas imunológicas e inflamação inapropriadas, o que resulta em lesão hepática grave. O aumento do nível de quimiocinas mediado pela ativação de NF-kB como resultado do estresse oxidativo no fígado, é uma das razões para o extravasamento de neutrófilos no parênquima hepático a partir da microvasculatura hepática. Este cenário é essencial para a ocorrência da referida lesão. 

O heme tem demonstrado ter um papel na indução da quimiotaxia de neutrófilos. Os autores propuseram que o heme e quimiocinas presentes no homogeneizado do fígado de camundongos infectados com malária atuam como importantes quimioatraentes para neutrófilos. A adesão dessas células aos hepatócitos desencadeia a produção de grande quantidade de espécies reativas de oxigênio. Logo, foi sugerido que a associação de NF-kB, estresse oxidativo e infiltração de neutrófilos no fígado constitui um ciclo vicioso em condições hemolíticas, o qual é responsável pela disfunção hepática. 

Finalmente, para confirmar a correlação do ferro livre e de oxidantes reativos derivados do heme livre em lesões hepáticas durante a malária, foram utilizados um quelante de ferro (Deferoxamina – DFO) que interage com o heme e um eliminador de radicais livres (NAC). Os resultados obtidos sugerem que o DFO e o antioxidante (NAC) reduziram a ativação de NF-kB no fígado, a expressão de quimiocinas como KC e MIP-2 e a expressão de moléculas de adesão de células endoteliais, como ICAM1 e VCAM1.  Além disso, a eliminação de oxidantes reativos e a quelação do ferro livre impediram a infiltração de neutrófilos no fígado. Portanto, a administração de um quelante de ferro e de um antioxidante pode ser considerada uma intervenção eficaz na prevenção da lesão hepática em condições hemolíticas.  

Sumanta Dey, Samik Bindu, Manish Goyal, Chinmay Pal, Athar Alam, Mohd. Shameel Iqbal, Rahul Kumar, Souvik Sarkar, & Uday Bandyopadhyay (2012). Impact of Intravascular Hemolysis in Malaria on Liver Dysfunction INVOLVEMENT OF HEPATIC FREE HEME OVERLOAD, NF-κB ACTIVATION, AND NEUTROPHIL INFILTRATION The Journal of Biological Chemistry, 287, 26630-26646

Carência de ferro protege contra malária grave e morte por Plasmodium falciparum em crianças jovens

Figura adaptada de Gwamaka et al., 2012: Deficiência de ferro é associada a uma menor % de visitas com parasitemia em todas as faixas etárias analisadas (odds ratio [95%confidence interval; CI] =  0.15 [0.12, 0.19], P <0,01). 

Post de Ligia C. L. de Souza

Já é algo estabelecido no cotidiano do médico clínico a pesquisa de sinais, sintomas e dados laboratoriais de anemia. Presente em cerca de 30% da população - principalmente devido à carência de ferro - a condição anêmica, especialmente em crianças, pode levar a um déficit cognitivo, motor, ponderal e estatural. Guidelines internacionais indicam, portanto, a suplementação deste micronutriente em crianças de áreas de alta prevalência de anemia.

A África Subsaariana é uma dessas áreas. Nessa região, além da deficiência de ferro, há a infecção pelo Plasmodium falciparum - condições que lá despontam como maiores responsáveis pela anemia. Apesar da alta prevalência de anemia assinalar a necessidade de suplementação de ferro, ainda não há segurança dessa medida em áreas endêmicas de malária. Alguns estudos apontam para a deficiência de ferro como um fator protetor contra a malária, embora outros não identifiquem essa relação. 

Assim, um estudo de Gwamaka et al, realizado no nordeste da Tânzania – pertencente à África Subsaariana – monitorou clínica e laboratorialmente 785 crianças do nascimento até três anos de idade verificando quanto à carência de ferro (através de amostras de sangue colhidas rotineiramente a depender da idade),  como também quanto ao desenvolvimento de malária (esfregaço sanguíneo e visita clínica a cada 2 semanas no 1º ano e posteriormente a cada mês).  Os casos de malária grave eram definidos de acordo com a presença de parasitas no esfregaço sanguíneo juntamente com a presença de um ou mais critérios definidos pela OMS que incluem parâmetros de: angustia respiratória, convulsão, prostração, hipoglicemia e anemia severa. Já os casos de deficiência de ferro foram definidos com a concentração de ferritina (corrigido de acordo com a presença ou não de inflamação). 

Ao fim de 113 semanas de seguimento, 16% das 785 crianças haviam desenvolvido malária, com uma parasitemia média de 829 P. falciparum /200 glóbulos brancos. A prevalência de deficiência de ferro era baixa nos neonatos, mas aumentou rapidamente ao longo da infância.  Crianças com carência de ferro avaliadas nesse estudo tinham em relação às crianças com níveis normais de ferro, 6,6 vezes menos chance de ter malária (ver figura), 3,9 vezes menor parasitemia, 24 vezes menos hiperparasitemia e 4 vezes menos malária grave. 

Ou seja, a carência de ferro está associada não somente a uma menor chance de contrair malária, mas também a uma menor densidade parasitária. Ainda nesse estudo, ao longo de 3 anos, a deficiência de ferro em crianças de área endêmica foi associada à redução de 66% de chance de morte por malária em relação às demais crianças. Estes resultados são um grande avanço para as estratégias de saúde nas regiões endêmicas de malária por P. falciparum. Há necessidade de esboçar restrições à suplementação de ferro nessas localidades, afinal a condição ferropriva é um fator protetor contra a infecção por P. falciparum em crianças.

Transpondo esses dados para a população brasileira, encontramos a malária localizada na região norte do país, causada neste caso predominantemente por P. vivax. Em estudo, Cardoso et. al. encontrou deficiência de ferro em 45,6% dentre 1111 crianças de 6 meses a 10 anos na Amazônia brasileira. É necessário, dessa maneira, questionar se essa carência de ferro também é fator protetor contra a infecção por P. vivax para elaborar com segurança estratégias de combate à anemia em crianças de regiões com alta incidência de malária. 

 Referências

WHO. Health topics: Anaemia. Disponível em: http://www.who.int/topics/anaemia/en/. Acesso em: Maio de 2012.

CARDOSO, M. A.; Scopel, K. K.G.; Muniz P.T.; Underlying Factors Associated With Anemia In Amazonian Children: A Population-Based, Cross-Sectional Study. Disponível em: www.plosone.org. Acesso em: Maio de 2012.

Gwamaka M, Kurtis JD, Sorensen BE, Holte S, Morrison R, Mutabingwa TK, Fried M, & Duffy PE (2012). Iron deficiency protects against severe Plasmodium falciparum malaria and death in young children. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 54 (8), 1137-44 PMID: 22354919

Diagnóstico de malária em mulheres grávidas

Figura adaptada de Mayor et al: Comparação entre HRP2 ELISA, HRP2-RDT e microscopia de sangue periférico na detecção de P. falciparum em mulheres grávidas (detectados com qPCR de sangue periférico ou na placenta) .

Post de Ligia C. L. de Souza

Na África, a cada ano cerca de 30 milhões de mulheres que vivem em região endêmica de malária engravidam. Durante a gravidez, com a queda da imunidade, as mulheres tornam-se mais suscetíveis à infecção por Plasmodium sp. e  suas complicações (anemia severa, morte, e maior risco fetal - prematuridade, aborto e baixo peso).  

Essa situação é agravada pela dificuldade do diagnóstico de malária nas grávidas. Isso se deve à capacidade do parasita em se alojar na placenta e permanecendo indetectável no sangue periférico. Por isso, em mulheres grávidas, as técnicas disponíveis para o diagnóstico de malária podem ser pouco sensíveis. Isso é um fator limitante do diagnóstico precoce e do tratamento efetivo contra o P.falciparum, itens fundamentais para redução da morbimortalidade e combate a essa moléstia neste grupo de pacientes.

Frente a esse impasse, Mayor et al avaliaram as ferramentas de diagnóstico de malária em mulheres grávidas em uma amostra de 272 grávidas participantes de um ensaio clínico realizado no sul de Moçambique – região com transmissão permanente de malária por P. falciparum. Assim, comparou-se o desempenho do exame microscópico (sangue periférico ou placenta), exame histológico da placenta, Diagnostic Rapid Tests – RDTs (que constata antígenos específicos do Plasmodium, como HRP2, no hospedeiro), Enzyme-linked Immunosorbent Assay de HRP2 (HRP2- ELISA) e qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) - técnica mais sensível, porém não aplicável em locais com poucos recursos. Como também associou os resultados desses testes à anemia materna e ao baixo peso das crianças ao nascer. 

Este estudo revelou que o teste rápido (HRP2-RDT), técnica passível de ser utilizada em áreas pobres em recursos, demonstrou maior sensibilidade que o método mais largamente utilizado (exame microscópico de sangue periférico). Apesar disso, HRP2-RDT e HRP2-ELISA (utilizando sangue periférico) foram incapazes de identificar cerca de 61% das infecções reveladas com qPCR do sangue periférico ou da placenta (ver figura).  O teste rápido e o ELISA também revelaram maior sensibilidade para a detecção de malária placentária superando a análise microscópica (placenta ou sangue periférico) e até mesmo exame histológico do órgão. Entretanto, HRP2-RDT e ELISA estão muito aquém da sensibilidade do qPCR da placenta ( 48,9% de sensibilidade de HRP2-RDT em relação ao qPCR).

O risco de anemia foi verificado em todas as mulheres que tiveram positividade em quaisquer dos testes investigados. Mesmo aquelas positivas em qPCR e negativas nos demais testes, apresentaram um risco aumentado de anemia. Todavia, não se conseguiu obter uma correlação significante entre baixo peso das crianças ao nascer e positividade nos testes, possivelmente por limitações do número amostral. 

Logo, o estudo de Mayor et al mostrou que tanto a microscopia, como exame histológico da placenta, e RDT-HRP2 ou ELISA-HRP2 têm uma falha de cerca de 60% da detecção de malária. Ou seja, 60% das mulheres grávidas podem não ter o diagnóstico de malária, o que inviabiliza um acesso precoce ao tratamento e, por conseguinte impede um melhor prognóstico. Necessita-se, portanto, de pesquisas acerca de biomarcadores e técnicas diagnósticas que aliem fácil acesso à boa sensibilidade.

Referências

WHO. Lives at risk: malaria in pregnancy. Disponível em: http://www.who.int/features/2003/04b/en/. Acesso em: Maio de 2012.

Mayor A, Moro L, Aguilar R, Bardají A, Cisteró P, Serra-Casas E, Sigaúque B, Alonso PL, Ordi J, & Menéndez C (2012). How hidden can malaria be in pregnant women? Diagnosis by microscopy, placental histology, polymerase chain reaction and detection of histidine-rich protein 2 in plasma. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America, 54 (11), 1561-8 PMID: 22447794

O Gene CCL3L1 e a Susceptibilidade à Malária

Post de Vitor R R de Mendonça

MIP-1α (macrophage inflammatory protein) é uma quimiocina responsável pela ativação e recrutamento de macrófagos. Esta molécula é secretada pela maioria dos leucócitos maduros e atua como um mediador pró-inflamatório, sendo inibida pela IL-4, IL-10 e IL-13. Os níveis séricos de MIP-1α estão aumentados em indivíduos com malária grave e não-complicada, induzindo a proliferação de macrófagos e expressão de TNF-α.

CCL3 e CCL3L1 são genes que codificam duas isoformas da MIP-1α, LD78α e LD78β respectivamente. Ambos os genes exibem um alto grau (96%) de homologia nas seqüências de nucleotídeos e a isoforma LD78β é 2x mais eficiente na quimiotaxia de monócitos e linfócitos do que a isoforma LD78α.  Além disso, ao contrário da presença de uma única cópia do CCL3, o gene CCL3L1 tem uma expressão variável de cópias, o que altera os níveis de MIP-1α (isoforma β). 

Recentemente publicado, o estudo de Carpenter e cols (2012) se propõe a investigar se a variação no número de cópias do CCL3L1 pode ter um papel na susceptibilidade ao número médio de episódios clínicos de malária, grau de parasitemia e níveis de hemoglobina. Para isto, um total de 922 indivíduos com malária por Plasmodium falciparum foram recrutados de uma população rural da Tanzânia entre 1993 e 1999 e genotipados para o número de cópias do gene CCL3L1. O número de cópias do gene na população do estudo (Africana) variou entre 0 a 10 cópias, com uma média de 04 cópias por indivíduo. O estudo do haplótipo (levando em consideração alelos microssatélites) demonstrou uma média de 2,1 cópias por cromossomo. Esse resultado contrasta com outros estudos com população Européia em que o número de cópias do CCL3L1 variou entre 0 a 05, com pico em 02 cópias do gene. Não se sabe ao certo a pressão evolutiva responsável pelo desenvolvimento e manutenção dessa divergência genética entre populações étnicas diferentes. 

Dentre os fenótipos analisados no estudo em questão (episódios de malária, parasitemia, hemoglobina), encontrou-se uma influência do número de cópias do CCL3L1 com os níveis de hemoglobina dos indivíduos. O número total de cópias do gene apresentou uma associação não-linear com os níveis de hemoglobina (p=0.035) e a análise específica por alelo identificou uma associação positiva dos valores de hemoglobina com o haplótipo de 2 cópias (p=0.021). Desta maneira, poucas cópias do gene CCL3L1 (associado a menor expressão de MIP-1α) está associado com a proteção contra anemia, ou altos níveis de hemoglobina, em pacientes com malária. 

Através dos resultados pouco expressivos do trabalho supracitado, conclui-se que não há evidências concretas e fortes sobre a participação do número de cópias do gene CCL3L1 em relação à susceptibilidade à malária por P. falciparum. Estudos em outras populações e com outras espécies do plasmódio devem ser realizados para ratificar os resultados do estudo de Carpenter e cols, visto que foi pioneiro na investigação desse perfil genético na malária.

Carpenter, D., Färnert, A., Rooth, I., Armour, J., & Shaw, M. (2012). CCL3L1 copy number and susceptibility to malaria Infection, Genetics and Evolution, 12 (5), 1147-1154 DOI: 10.1016/j.meegid.2012.03.021

Citometria de fluxo para avaliar infecção por esporozoítos de Plasmodium falciparum

Post de Gabriela B. C. Garcia

A malaria resulta, anualmente, em 800.000 mortes em todo o mundo (Snow et al, 2005). A infecção sintomática pelo Plasmodium só é detectada quando os merozoítos infectam as hemácias, após a reprodução dos esporozoítos nos hepatócitos (Vaughan et al, 2008). O desenvolvimento de mecanismos que interfiram na infecção pré-eritrocítica é fundamental, visto a ausência de sintomas clínicos no estágio hepático da doença. 

Ensaios para mensurar a inibição da infecção pré-clínica são datados da década de 1980 e basearam-se em microscopia. Em busca de mecanismos que possam monitorar quantitativamente as taxas de invasão e inibição, Kaushansky et al (2012) propuseram um teste por citometria de fluxo. Este teste é capaz de avaliar a inibição da infecção por drogas e a eficácia de anticorpos no bloqueio da invasão.  A necessidade de monitoramento deve-se à ausência de uma droga que bloqueie o esporozoíto, e ao fato de que ensaios (ELISA) com a vacina mais eficaz contra a malária clínica (50% de eficácia, segundo Agnandji et al, 2011) não demonstraram a relação entre a proteção e a funcionalidade das respostas dos anticorpos. 

Basicamente três testes são utilizados para a avaliação da infecção por esporozoítos (Ver tabela).

Devido às limitações de rendimento dos ensaios disponíveis, foi desenvolvida a técnica de monitoramento por citometria de fluxo.  Neste experimento, foram cultivados hepatócitos HC04 que, de acordo com Karnasuta et al (1995), suportam invasão e desenvolvimento de P. falciparum  in vitro. Em seguida, estas células foram infectadas com esporozoítos e incubadas durante 90 min. Após este tempo, as células foram separadas, fixadas e permeabilizadas, posteriormente coradas com um anticorpo monoclonal (2A10) para a circumsporozoite protein (CSP) do P.  falciparum.  A análise fundamentou-se na percentagem de hepatócitos que foram infectados pelos parasitas e na identificação de hepatócitos com altos níveis de CSP (Fig 1A-B). 

A capacidade dessa técnica para monitorizar a inibição do esporozoíto pela droga também foi avaliada. Os esporozoítos foram tratados com Citocalasina D, molécula capaz de inibir a polimerização da actina do parasita, o que ocasionou acentuada diminuição da capacidade de invasão celular (Fig 1D).

Esporozoítos foram incubados sem ou com quatro concentrações diferentes de anticorpo monoclonal purificado para CSP. Esse procedimento permitiu a caracterização das taxas de invasão devido ao bloqueio por anticorpos. A invasão pelos esporozoítos foi inibida de acordo com a concentração do anticorpo (Fig 1E-G). 

O estudo em questão apresentou o desenvolvimento de uma metodologia eficiente, quantitativa e imparcial para a monitoração da invasão de esporozoítos de P. falciparum.  Esta técnica contribui para o desenvolvimento de possíveis fármacos capazes de impedir a infecção pré-eritrocítica, assim como auxilia na elucidação de respostas de anticorpos funcionais em abordagens clínicas. 

Kaushansky, A., Rezakhani, N., Mann, H., & Kappe, S. (2012). Development of a quantitative flow cytometry-based assay to assess infection by Plasmodium falciparum sporozoites Molecular and Biochemical Parasitology, 183 (1), 100-103 DOI: 10.1016/j.molbiopara.2012.01.006

Mortalidade global pela malária entre 1980 e 2010

Post de Vitor R R de Mendonça

Em 2011 o secretário geral da ONU traçou a meta de reduzir as mortes por malária a zero em 2015. Além disso, o investimento financeiro nesta doença aumentou de U$149 milhões em 2000 para quase U$1-2 bilhões em 2008. Desta maneira, é importante ter uma estimativa aproximada do número de mortes por malária ao longo do tempo para ter o retorno da eficácia dos investimentos e futuros financiamentos. Recentemente publicado no The Lancet, Murray e cols propõem através de uma análise sistemática estimar a mortalidade por malária entre 1980 e 2010, trabalho este financiado pela Fundação Bill & Melinda Gates. 

Os autores usaram um grande banco de dados que incluíram dados de registro vital (o que é isto? veja aqui ) e estudos de autópsia verbal (o que é? aqui) publicados e não publicados para desenvolver modelos empíricos de mortalidade por malária de acordo com a idade, gênero e país, de 1980 a 2010. Neste período, as mortes por malária aumentaram de 995,000 em 1980 para um pico de 1,817,000 em 2004. Em 2010 foram 1,238,000 mortes, uma redução de 32% desde 2004. A maioria das mortes em todas as faixas etárias ocorreu no oeste, leste e África central. No sul e sudeste asiático, as mortes em crianças <5 anos diminuíram desde 1980 e representaram uma pequena proporção em 2010. Em contraste com essa tendência, morte em indivíduos >5 anos na Ásia contou por uma grande proporção das mortes por malária nesta faixa etária em 2010.

Murray também apresentou em seus resultados a estimativa detalhada por país do número de mortes por malária e a probabilidade cumulativa de morrer pela doença na ausência de outra causa de morte de acordo com a faixa etária para os anos de 1980, 1990, 2000 e 2010. No que se refere ao Brasil, o número de mortes diminui de 955 em 1980 para 117 em 2010, com uma redução também na probabilidade de morrer de 0,7% em 1980 a <0.1% em 2010. De todas as mortes por malária, uma pequena proporção ocorreu nos 15 países com somente a espécie Plasmodium vivax. Em 1980 foi estimado 751 mortes por esta espécie e em 2010 apenas 9 mortes, e um total cumulativo de 5169 mortes. Vale ressaltar que o Brasil, assim como outros países, não entraram nessa análise já que apresentam ambas as espécies do plasmódio, então os dados mostrados não representam o número real de mortes por P. vivax. 

Apesar das mortes por malária em crianças contarem pela maioria das mortes, o número de mortes em adultos é alto. Mortes em indivíduos com 15-49 anos, 50-69 anos e maiores de 70 anos corresponderam por 20%, 9% e 6% das mortes em 2010, respectivamente. Através de uma análise detalhada incluindo dados de 1920-1980 e a mortalidade hospitalar fornecida diretamente por oito ministros da saúde, percebeu-se que esse número é ainda maior em indivíduos >15 anos (58% na África subsaariana, 76% na Ásia e 69% nas Américas), com exceções aos países fora da África subsaariana com altas taxas de transmissão. Isso vai de encontro com o conhecimento tradicional que argumenta que a imunidade adquirida em áreas hiperendêmicas não levaria adultos a morrerem por malária. 

Os achados do trabalho citado demonstraram mais mortes em todas as idades e regiões do que o “World Malaria Report 2011” em 2010: 1.3x maior para crianças <5 anos na África, 8.1x maior em aqueles >5 anos na África e 1.8x maior para indivíduos de todas as faixas etárias fora da África. Desde o pico global de 2004, provavelmente como resultado da resistência à cloroquina, tem sido visto uma diminuição acentuada de mortes devido às atividades de controle da malária na África subsaariana, principalmente financiadas pelo Fundo Global de Luta contra a AIDS, Tuberculose e Malária. As principais atividades que levaram a redução no número de mortes foram o surgimento do tratamento farmacológico combinado com artemisina e estratégias de controle do vetor. 

As estimativas maiores de morte vistas no estudo de Murray descartam as metas da OMS de reduzir a zero as mortes por malária em 2015. Estimou-se neste trabalho que se a mortalidade continuar diminuindo, em 2020 teremos menos de 100,000 mortes. Contudo, devido à crise econômica global, está acontecendo uma redução nos investimentos para controle da malária e isso é um perigo iminente para a saúde da população em países endêmicos. Desta forma, o desenvolvimento de novos tratamentos (farmacológicos, atividades de controle do vetor e vacinas) de baixos custos e altas eficácias permanecem como as principais metas dos pesquisadores para uma possível erradicação da malária.

Referencia:
Murray, C., Rosenfeld, L., Lim, S., Andrews, K., Foreman, K., Haring, D., Fullman, N., Naghavi, M., Lozano, R., & Lopez, A. (2012). Global malaria mortality between 1980 and 2010: a systematic analysis The Lancet, 379 (9814), 413-431 DOI: 10.1016/S0140-6736(12)60034-8

Estudo Metabolômico Urinário em Infecção por Plasmodium vivax

Post de Gabriela B. C. Garcia

Parasitas do gênero Plasmodium sp.  são os agentes etiológicos da malária, doença milenar que acomete 200 a 300 milhões de pessoas por ano. Ocorre principalmente na África Subsaariana, no Sudeste Asiático, entre outras regiões. Na Índia, o Plasmodium vivax é o principal responsável pela malária clínica (Joshi et al, 2008). Admite-se que a patogenicidade da doença esteja fortemente associada a complicações metabólicas resultantes da interação parasita/hospedeiro (obtenção de nutrientes ou liberação de metabólitos tóxicos pelo parasita). 

As infecções por P. vivax eram consideradas brandas, no entanto, relatos recentes de vários locais do mundo, incluindo os trabalhos de Andrade et al do nosso grupo, apontam que esta espécie também pode provocar malária grave. Assim, é importante compreender como a relação de parasitismo interfere no metabolismo do hospedeiro e na sua resposta à infecção. 

No artigo recém publicado no Malaria Journal, foi feita uma análise da resposta metabólica do hospedeiro associada à infecção, através de espectroscopia de RMN baseada em técnicas de metabonômica. Foram determinados três grupos de estudo: pacientes infectados por P. vivax, indivíduos sadios e pacientes febris não infectados por malária. Amostras de urina das classes citadas foram coletadas, submetidas à espectroscopia por ressonância magnética nuclear (RMN) e posterior análise estatística multivariada. A metabonômica é uma tecnologia que analisa de maneira global os metabólitos presentes nos fluidos biológicos que, seguida de métodos estatísticos [PCA] e/ou [OPLSDA], é capaz de traçar um perfil metabólico. A identidade da substância que é perturbada em resposta ao fator de estresse (genético ou ambiental) de interesse pode ser determinada com esta metodologia (Lindon et al, 2001). Esta técnica tem sido utilizada na identificação de novos biomarcadores em diferentes doenças. 

Os perfis metabólicos urinários dos grupos em estudo foram comparados com a finalidade de obtenção de marcadores específicos da malária. Os resultados demonstraram diferenças significativas no perfil metabólico urinário de pacientes com malária P. vivax, indivíduos sadios e pacientes febris não malária. De acordo com essas dessemelhanças, os metabólitos que foram delineados possibilitam o diagnóstico não invasivo da doença. 

Vários metabólitos diferiram entre os pacientes infectados e os dois grupos controle (ver tabelas 3 e 4). Entretanto, a observação de um aumento significativo nos níveis de ornitina e de N-acetilornitina na urina de indivíduos com malária (em comparação com pacientes febris não malária e indivíduos saudáveis, respectivamente), ratifica informações anteriores sobre o aumento de OCT no soro associado ao dano das células hepáticas (Lopansri  et al, 2006 e Sampath et al, 2002); ciclo da uréia prejudicado, e toxicidade por amônia durante malária em camundongos (Penet et al, 2007).  

A partir destas observações foi possível inferir que a diminuição significativa da ornitina no plasma de pacientes com malária clínica (Lopansri  et al, 2006) é devida ao aumento da excreção deste metabólito em pacientes infectados. 

Em conformidade com estudos anteriores e de razão desconhecida, foi observado um leve aumento nos níveis de ácido pipecólico em pacientes infectados versus pacientes febris não malária. O ácido pipecólico está associado a doenças crônicas do fígado nos seres humanos, o que contribui para a associação da malária com a disfunção hepática.  

Logo, foi possível determinar um perfil metabólico urinário em infecções por P. vivax, caracterizado principalmente pela alteração no ciclo da uréia e excreção aumentada de ornitina, altos níveis de ácido pipecólico e, consequentemente, provável lesão hepática. O trabalho em discussão foi pioneiro na análise metabolômica/metabonômica da malária humana e determinação da ornitina como possível biomarcador urinário da infecção malárica. Assim, novas possibilidades de diagnóstico não invasivo da malária podem surgir a partir da obtenção de biomarcadores específicos.     

Figura do site IsoLife

Sengupta, A., Ghosh, S., Basant, A., Malusare, S., Johri, P., Pathak, S., Sharma, S., & Sonawat, H. (2011). Global host metabolic response to Plasmodium vivax infection: a 1H NMR based urinary metabonomic study Malaria Journal, 10 (1) DOI: 10.1186/1475-2875-10-384

Mosquitos transgênicos com ativação do seu sistema imune inato são resistentes à infecção por Plasmodium

Publicado originalmente no SBlogI (aqui)

Post de Vitor R R de Mendonça

Vacinas eficazes contra a malária humana permanecem sob investigações científicas, sem uma perspectiva concreta de sucesso a curto prazo.  Muitas das abordagens vacinais são dirigidas para aumentar a resposta imune do hospedeiro contra o Plasmodium.  Por outro lado, alguns pesquisadores têm dado atenção especial ao controle da infecção através do vetor do plasmódio, o mosquito do gênero Anopheles.  

O grupo do Prof. Marcelo Jacobs-Lorena tem feito diversas contribuições sobre manipulação dos vetores com potencial aplicação no controle da malária:

Dinglasan, R.R. et al., 2007. Disruption of Plasmodium falciparum development by antibodies against a conserved mosquito midgut antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(33), pp.13461–13466.

Yoshida, S. et al., 2007. Hemolytic C-type lectin CEL-III from sea cucumber expressed in transgenic mosquitoes impairs malaria parasite development. PLoS Pathogens, 3(12), p.e192.

Fang, W. et al., 2011. Development of transgenic fungi that kill human malaria parasites in mosquitoes. Science, 331(6020), pp.1074–1077.

Recentemente publicado na Plos Pathogens, o artigo de Dong et al. também discorre sobre Anopheles transgênicos resistentes à infecção pelo Plasmodium.

O sistema imune inato do Anopheles é capaz de produzir diversos fatores imunes anti-Plasmodium identificados como TEP1, APL1, LRPD7, e FBN9, sendo todos controlados pela via do IMD através do fator de transcrição Rel2. No estudo supracitado, pela primeira vez, pesquisadores desenvolveram mosquitos geneticamente modificados da espécie Anopheles stephensi que expressavam altos níveis da forma ativa da Rel2 através de promotores indutores suplementados na alimentação (repasto sanguíneo): carboxylpeptidase (Cp) ou vitellogenin (Vg). Gerou-se, desta forma, linhas transgênicas Cp-Rel2 e Vg-Rel2, assim como um híbrido com expressão de Rel2 tanto nos tecidos do intestino médio (Cp) quanto no tecido adiposo (Vg). As três linhagens de mosquitos demonstraram potente atividade anti-Plasmodium falciparum, além de resistência à infecção pelas bactérias gram negativas. Quando os mosquitos foram alimentados com cultura de gametócitos de P. falciparum, a intensidade da infecção por oocistos se reduziu nas 3 linhagens quando comparados com o genótipo selvagem (redução de 77,1%, 48,6% e 82,9% nos insetos Cp-Rel2, Vg-Rel2 e híbrido, respectivamente). O Cp-Rel2 e o híbrido foram mais resistentes à infecção do que a linha específica para o tecido adiposo (Vg-Rel2), sugerindo que o parasita é mais susceptível ao ataque imune através da ativação da via IMD no intestino médio pela Rel2 mediada pela carboxypeptidase. Estes dados foram confirmados visto que as linhagens Cp-Rel2 e híbrido expressando Rel2 recombinante no intestino médio diminuíram o estágio de oocito do parasita antes da invasão do epitélio intestinal, enquanto que a Vg-Rel2 apenas demonstrou uma maior capacidade de inibir os estágios do Plasmodium após a invasão. Os autores também ratificaram que o transgene Rel2 confere resistência ao plasmódio através da ativação de múltiplos genes efetores (TEP1, ALP1, LRRD7) já que o silenciamento de cada um desses genes em separado não resultou em aumento da taxa de infecção.

Estudos, sob condições laboratoriais, desses mosquitos demonstraram apenas um fraco impacto negativo da expressão transgênica na longevidade e fecundidade do inseto. Vale ressaltar que o método utilizado na produção dos transgênicos não envolve a introdução de genes recombinantes externos, mas a potencialização do sistema imune do mosquito através da expressão aumentada do fator de transcrição Rel2 através de promotores presentes na alimentação. 

Pioneiros em seu estudo, Dong et al. sugeriram uma possível alternativa para o controle da malária através do controle do sistema imune do vetor. Contudo, outros estudos serão necessários para ratificar os resultados demonstrados e verificar a biodisponibilidade e possível impacto ambiental da introdução da suplementação com promotores de Rel2 na dieta de Anopheles na natureza.

Dong Y, Das S, Cirimotich C, Souza-Neto JA, McLean KJ, & Dimopoulos G (2011). Engineered anopheles immunity to Plasmodium infection. PLoS pathogens, 7 (12) PMID: 22216006

O potencial do uso de biomarcadores combinados: o caso da malária placentária oculta

Post de Bruno Sangiorgi

Apesar dos eritrócitos serem o alvo do agente etiológico da malária, diversas complicações localizadas da doença, em órgãos como o cérebro e olhos, podem ocorrer devido ao sequestro dos eritrócitos nestes locais. Este é o caso da malária placentária oculta (OPM), uma forma de malária que ocorre na gravidez mas não pode ser detectada por métodos convencionais como macerado do sangue periférico. Mulheres com OPM podem apresentar complicações na gravidez e por isso é recomendado a aplicação de antimalariais independente da apresentação de sintomas da doença.

Esta administração indiscriminada de medicamentos pode ainda causar problemas, como efeitos colaterais, aumento de resistência do parasita, além do gasto desnecessário com os medicamentos. Visando otimizar este processo, recentemente foi publicado um estudo sobre a possibilidade de algumas proteínas presentes no sangue periférico, quando analisadas de modo conjunto, serem utilizadas como indicadores biológicos (biomarcadores) desta doença. A identificação dos biomarcadores para OPM poderia ser utilizado para direcionar o tratamento aos indivíduos cujas concentrações destas proteínas indiquem a presença da doença.

Para identificar os biomarcadores para OPM, comparações dos níveis de certas proteínas foram feitas entre dois grupos, “com OPM (n = 24)”: qual foram incluídas mães cujos parasitas foram detectados tanto no sangue periférico quanto na placenta, e “sem OPM (n = 326)”: cujos parasitas não foram detectados no sangue periférico e placenta. Tenho dúvidas se este foi o melhor delineamento experimental, pois houveram casos (n = 21) de parasitas detectados no sangue periférico mas não na placenta, sendo estes casos descartados. Quem sabe a formação de um terceiro grupo com estes casos, um grupo de “malária não-OPM”, poderia fornecer um ajuste fino na identificação de biomarcadores somente para OPM, discriminando casos de malária não placentária na gravidez.

De qualquer modo, das proteínas comparadas por curvas ROC entre ambos os grupos, níveis séricos de proteína-C reativa (CRP), fms-like tirosina kinase-1 tipo fms (sFlt-1) e leptina obtiveram, individualmente, modestas AUC em torno de 70. Para analisar o potencial conjunto destas proteínas em identificar indivíduos com OPM, valores foram atribuídos abaixo do cutoff para CRP ou acima para sFlt-1 e leptina, formando então um escore (biomarker score), que quando comparado entre os mesmos grupos, resultaram em uma curva ROC com AUC de 83 e 100% de especificidade. Além disso, outro escore foi elaborado somando a pontuação atribuída as curvas ROC das proteínas  com outra pontuação atribuída a variáveis clínicas (anemia e febre), gerando um novo escore (clínical + biomarker score) com AUC ligeiramente superior (85).

Tenho dúvidas acerca da aplicabilidade no uso de características clínicas juntamente a laboratoriais (dosagem das proteínas) em escores, devido a sua subjetividade e dificuldade de apuração, principalmente em casos quais o aumento no poder discriminatório é pequeno. O uso somente dos biomarcadores combinados, apesar de requisitar uma quantidade maior de análises laboratoriais (cada proteína foi quantificada por um kit de ELISA), pode funcionar como uma ferramenta poderosa, especialmente quando isoladamente as proteínas sugeridas não possuem uma capacidade satisfatória de discriminação. Apesar deste estudo específico ter seu foco na OPM, seu método relativamente simples de atribuir valores com base em concentrações acima ou abaixo da curva ROC pode ser aplicada em todo estudo qual mais de uma proteína esteja sendo avaliada.

Conroy, A.L., Liles, W.C., Molyneux, M.E., Rogerson, S.J., Kain, K.C. (2011). Performance Characteristics of Combinations of Host Biomarkers to Identify Women with Occult Placental Malaria: A Case-Control Study from Malawi PLoS ONE, 6 (12) : 10.1371/journal.pone.0028540

Imunorregulação na malaria vivax e polimorfismo de IL-10

Increased interleukin-10 and interferon-γ levels in Plasmodium vivax malaria suggest a reciprocal regulation which is not altered by IL-10 gene promoter polymorphism

Post de Lígia C. L. de Souza

Quando tratamos de doenças infecciosas, a resposta imune adquirida pode representar tanto a possibilidade de eliminar o agente etiológico como a de gerar uma resposta exacerbada responsável (em grande parte) pelos sintomas. Para a malária humana essa retórica é bastante pertinente. A resposta ao parasita é coordenada por mecanismos pró-inflamatórios e por mecanismos moduladores. Esse balanço entre as citocinas é responsável pelas diferentes expressões da doença. Esse jogo de citocinas não está totalmente desvendado em infecções por Plasmodium vivax, mas estudos apontam que altos níves de citocinas pró-inflamatórias (TNF, IFN-γ e IL-6) são encontrados em manifestações graves da doença, enquanto que baixos níveis de citocinas reguladoras (TGF-β e IL-10) são associadas a doença aguda (ver gráfico). 

Gráfico adaptado de: Andrade BB et al, 2010. NI: non-infected; Asy: asymptomatic malaria; Mild: mild malaria; Sev: severe malaria. 

Dentre os fatores que podem interferir na produção dessas citocinas, está o polimorfismo de genes codificadores. Neste cenário, o estudo de Medina et al, recentemente publicado no Malaria Journal, retrata a relação entre a frequência de polimorfismos, os níveis de citocinas IL-10/IFN-γ e parasitemia. A partir de amostras de sangue de 132 pacientes infectados com P.vivax e 86 controles (estado do Pará), foram realizadas dosagens de citocinas IL-12, IL-4, IFN-γ e IL-10 e PCR do polimorfismo SNP (Single Nucleotide Polymorphism) do gene do IFN-y  (IFN-y +874 A/T) e do gene da IL-10 (IL-10 -1082 G/A). O primeiro polimorfismo está associado com um aumento da produção IFN-y em tuberculosos e o segundo, vinculado a uma redução da expressão de IL-10 em pacientes com malária falciparum. 

Encontraram-se níveis aumentados de IL-10 e IFN-y em pacientes infectados em relação ao grupo controle, bem como um aumento das citocinas condizente com o aumento de parasitemia. A concentração de IFN-y foi maior em pacientes primoinfectados, o que sugere uma resposta mais intensa na primeira infecção. Ao analisar o polimorfismo do INF-y, foi constatado um efeito redutor na produção de IFN-y para os homozigotos selvagens, mas sem relação com a parasitemia. Já o polimorfismo de IL-10, não foi estatisticamente significante na redução dos níveis dessa citocina. Não houve associação entre o genótipo das referidas citocinas e a parasitemia. Por fim, o estudo sugere que a regulação negativa de IL-10 e o polimorfismo de IFN-y fornecem mecanismos de controle em P. vivax. 

O estudo foi pioneiro ao tentar relacionar o polimorfismo de IL10, uma importante citocina reguladora, apontada como importante protetora na malária. Ele demonstrou que o polimorfismo regulador de IFN-y e de IL-10 não está relacionado com o controle da parasitemia. Demonstra-se, portanto, uma necessidade de maiores estudos em malária P. vivax, investigando fatores moduladores da resposta imune, fatores de proteção e possíveis alvos terapêuticos no combate a essa doença.

Andrade BB, Reis-Filho A, Souza-Neto SM, Clarêncio J, Camargo LMA, Barral A, Barral-Netto M. Severe Plasmodium vivax malaria exhibits marked inflammatory imbalance. Malar J.2010;9:13. doi: 10.1186/1475-2875-9-13

Medina et al. Increased interleukin-10 and interferon-g levels in Plasmodium vivax malaria suggest a reciprocal regulation which is not altered by IL-10 gene promoter polymorphism. Malaria Journal 2011, 10:264  doi: 10.1186/1475-2875-10-264