Mosquitos transgênicos com ativação do seu sistema imune inato são resistentes à infecção por Plasmodium

Publicado originalmente no SBlogI (aqui)

Post de Vitor R R de Mendonça

Vacinas eficazes contra a malária humana permanecem sob investigações científicas, sem uma perspectiva concreta de sucesso a curto prazo.  Muitas das abordagens vacinais são dirigidas para aumentar a resposta imune do hospedeiro contra o Plasmodium.  Por outro lado, alguns pesquisadores têm dado atenção especial ao controle da infecção através do vetor do plasmódio, o mosquito do gênero Anopheles.  

O grupo do Prof. Marcelo Jacobs-Lorena tem feito diversas contribuições sobre manipulação dos vetores com potencial aplicação no controle da malária:

Dinglasan, R.R. et al., 2007. Disruption of Plasmodium falciparum development by antibodies against a conserved mosquito midgut antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(33), pp.13461–13466.

Yoshida, S. et al., 2007. Hemolytic C-type lectin CEL-III from sea cucumber expressed in transgenic mosquitoes impairs malaria parasite development. PLoS Pathogens, 3(12), p.e192.

Fang, W. et al., 2011. Development of transgenic fungi that kill human malaria parasites in mosquitoes. Science, 331(6020), pp.1074–1077.

Recentemente publicado na Plos Pathogens, o artigo de Dong et al. também discorre sobre Anopheles transgênicos resistentes à infecção pelo Plasmodium.

O sistema imune inato do Anopheles é capaz de produzir diversos fatores imunes anti-Plasmodium identificados como TEP1, APL1, LRPD7, e FBN9, sendo todos controlados pela via do IMD através do fator de transcrição Rel2. No estudo supracitado, pela primeira vez, pesquisadores desenvolveram mosquitos geneticamente modificados da espécie Anopheles stephensi que expressavam altos níveis da forma ativa da Rel2 através de promotores indutores suplementados na alimentação (repasto sanguíneo): carboxylpeptidase (Cp) ou vitellogenin (Vg). Gerou-se, desta forma, linhas transgênicas Cp-Rel2 e Vg-Rel2, assim como um híbrido com expressão de Rel2 tanto nos tecidos do intestino médio (Cp) quanto no tecido adiposo (Vg). As três linhagens de mosquitos demonstraram potente atividade anti-Plasmodium falciparum, além de resistência à infecção pelas bactérias gram negativas. Quando os mosquitos foram alimentados com cultura de gametócitos de P. falciparum, a intensidade da infecção por oocistos se reduziu nas 3 linhagens quando comparados com o genótipo selvagem (redução de 77,1%, 48,6% e 82,9% nos insetos Cp-Rel2, Vg-Rel2 e híbrido, respectivamente). O Cp-Rel2 e o híbrido foram mais resistentes à infecção do que a linha específica para o tecido adiposo (Vg-Rel2), sugerindo que o parasita é mais susceptível ao ataque imune através da ativação da via IMD no intestino médio pela Rel2 mediada pela carboxypeptidase. Estes dados foram confirmados visto que as linhagens Cp-Rel2 e híbrido expressando Rel2 recombinante no intestino médio diminuíram o estágio de oocito do parasita antes da invasão do epitélio intestinal, enquanto que a Vg-Rel2 apenas demonstrou uma maior capacidade de inibir os estágios do Plasmodium após a invasão. Os autores também ratificaram que o transgene Rel2 confere resistência ao plasmódio através da ativação de múltiplos genes efetores (TEP1, ALP1, LRRD7) já que o silenciamento de cada um desses genes em separado não resultou em aumento da taxa de infecção.

Estudos, sob condições laboratoriais, desses mosquitos demonstraram apenas um fraco impacto negativo da expressão transgênica na longevidade e fecundidade do inseto. Vale ressaltar que o método utilizado na produção dos transgênicos não envolve a introdução de genes recombinantes externos, mas a potencialização do sistema imune do mosquito através da expressão aumentada do fator de transcrição Rel2 através de promotores presentes na alimentação. 

Pioneiros em seu estudo, Dong et al. sugeriram uma possível alternativa para o controle da malária através do controle do sistema imune do vetor. Contudo, outros estudos serão necessários para ratificar os resultados demonstrados e verificar a biodisponibilidade e possível impacto ambiental da introdução da suplementação com promotores de Rel2 na dieta de Anopheles na natureza.

Dong Y, Das S, Cirimotich C, Souza-Neto JA, McLean KJ, & Dimopoulos G (2011). Engineered anopheles immunity to Plasmodium infection. PLoS pathogens, 7 (12) PMID: 22216006

Aedes sem asas podem controlar a dengue?

Foi divulgado no early view do PNAS o artigo “Female-specific flightless phenotype for mosquito control” de Fu et al. (doi: 10.1073/pnas.1000251107) que relata a obtenção de fêmeas de Aedes aegypti sem asas, o que as torna efetivamente estéreis pois a reprodução da espécie depende do barulho feito pelas asas para atração dos machos. Isto pode ser uma estratégia para o controle da dengue?

A dengue continua a representar importante problema de saúde pública, com estimativas de 50 a 100 milhões de novas infecções por ano, e o Aedes aegypti é o principal vetor do vírus da dengue. O controle deste mosquito é considerado central nas estratégias de controle da dengue. As estratégias de controle do Aedes envolvem pulverização de inseticidas, com impacto sobre outras espécies e sobre o meio ambiente. Por isto, são buscadas outras alternativas.

A estratégia de liberação de machos estéreis (por irradiação) é utilizada em diversas situações. A biofabrica MoscaMed em Juazeiro (Bahia) produz machos estéreis de insetos que representam pragas da agricultura. Visa principalmente o controle da mosca Ceratitis capitata ou mosca de mediterrâneo (moscamed) que coloca seus ovos no interior das frutas. 

No trabalho discutido agora, os Aedes transgênicos foram desenvolvidos para que as fêmeas não desenvolvessem asas baseado no uso de promotor indireto para o músculo da asa, fêmea-específico, do gen Actina-4 do Aedes aegypti. Com isto se elimina a necessidade de irradiação e ao mesmo tempo é possível o uso dos ovos, para liberação no ambiente, e não de insetos adultos. Há várias vantagens nisto. Os ovos são mais facilmente transportados e sofrem menos na sua liberação no campo. Espera-se que com tal estratégia seja possível liberar um número tão grande de Aedes incapazes que estes superem os selvagens na área endêmica.

O aspecto da capacidade de sobrevivência no campo e sua maior capacidade de multiplicação e sobrevivência que o organismo selvagem é justamente o ponto fraco deste estudo. Em 2007, o grupo do Prof. Marcelo Jacobs-Lorena publicou no PNAS um artigo sobre mosquitos resistentes à malária (Transgenic malaria-resistant mosquitoes have a fitness advantage when feeding on Plasmodium-infected blood; PNAS 27;104(13):5580-3, 2007 doi: 10.1073/pnas.0609809104) onde descrevem a estratégia de introdução de gens que prejudicam o desenvolvimento do Plasmodium nos mosquitos. Eles haviam demonstrado que anofelíneos que expressam o peptídeo SM1 na luz do intestino médio têm prejuízo na transmissão de Plasmodium berghei. Um aspecto que os autores destacam no artigo é que os mosquitos transgenicos devem manter o fitness, não apresentando um desempenho menor que os selvagens, pois do contrário teriam dificuldade de sobrepujar os mosquitos selvagens e assim promover o controle. No caso do trabalho eles demonstram que os mosquitos transgênicos têm maior fecundidade e menor mortalidade que os selvagens. 

Os autores reconhecem a limitação:

“Further studies are needed to assess the mating competitiveness of males of specific strains, and their operational effectiveness in suppressing wild mosquito populations.”

De todo modo, e como também reconhecido pelos autores, estes Aedes transgênicos, mesmo se demonstrarem fitness apropriado em condições de campo, precisam ser integrados numa estratégia de controle e terão pouca utilidade se empregados isoladamente.

Ilustração Fig. 2 (parte) do artigo: Male and female adults (OX3604C þ tRE-DsRed) under white (E) and fluorescent light (F). Strong red fluorescence is visible in the IFMs of females, but not of males.

Fu, G., Lees, R., Nimmo, D., Aw, D., Jin, L., Gray, P., Berendonk, T., White-Cooper, H., Scaife, S., Kim Phuc, H., Marinotti, O., Jasinskiene, N., James, A., & Alphey, L. (2010). Female-specific flightless phenotype for mosquito control Proceedings of the National Academy of Sciences DOI: 10.1073/pnas.1000251107

Isca capaz de atrair o Anopheles mais que o odor humano

Post de Petter Entringer

Um aspecto significante do comportamento de insetos hematófagos é a busca pelo hospedeiro vertebrado na tentativa de localizar a fonte alimentar. Para muitos desses insetos que são vetores de doenças, o sucesso da busca poder resultar não apenas na obtenção do alimento, mas também na transmissão de agentes patogênicos. 

Os dípteros se utilizam de órgãos de alta sensibilidade para rastrear agentes químicos e físicos oriundos dos hospedeiros. Mosquitos por exemplo, através de órgãos olfatórios percebem a presença e são atraídos por produtos do metabolismo, como CO₂, ácido lático e amônia liberados pela pele, suor e respiração de vertebrados.  

Os agentes e características destes processos têm despertado o interesse de pesquisadores devido a sua importância para a epidemiologia de doenças como a malária, dengue e febre amarela transmitidas por mosquitos de diversos gêneros, durante a alimentação no homem. Uma das abordagens mais empregadas é a identificação e síntese in vitro de odores que podem ser reformulados para elaboração de misturas que “mimetizam” humanos, para atrair mosquitos. 

Em janeiro, a PLoS ONE publicou um trabalho de Fredros Okumu e colaboradores – Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans, volume 5, Issue 1, e8951 – no qual além de sintetizarem odorantes atrativos a Anopheles gambiae sensu stricto , vetor da malária, pela primeira vez testaram os agentes no ambiente natural desses insetos e não apenas em laboratório.  A eficácia da mistura composta por amônia, ácido lático, gás carbônico e ácidos carboxílicos alifáticos em competir com humanos – voluntários locais – foi testada em uma vila com altas taxas de transmissão de malária no interior da Tanzânia.

Quando a atração a cabanas distantes 10 a 100 metros uma das outras, foi comparada, aquelas que abrigavam apenas a mistura de odorantes atraíram mais mosquitos, incluindo anophelinos e culicídeos, do que as cabanas onde estavam apenas homens, demonstrando eficácia da mistura na competição a longa distância. Além disso, cabanas que continham homens e odorantes atraíram mais mosquitos do que aquelas que abrigavam apenas homens. Por outro lado, quando a comparação foi feita no interior de cabanas que abrigavam tanto homens quanto a mistura odorante, as diferentes espécies de mosquitos foram atraídas de forma igual ou preferencialmente para os homens. Na competição a curta distância, parece que a eficácia da mistura sintética foi suplantada pela relação forjada durante milhares de anos pela evolução. 

Os autores discutem a capacidade desse odorante sintético a atrair mosquitos da mesma maneira que odores humanos, mesmo sem conter todos os componentes biologicamente ativos naturalmente liberados pelos homens. Destacam também a atuação da mistura como atrativo competidor em longa distância, que poderia ser empregada para atrair mosquitos para armadilhas no peridomicílio, evitando que localizem e se alimentem em seres humanos no interior das residências.  Outra utilização para a mistura, que vale a pena ser destacada, seria como substituta de seres humanos como iscas para armadilhas para mosquitos em estudos científicos.

Embora o estudo tenha sido pioneiro ao avaliar o odorante em uma área endêmica para malária, fica evidente que a mistura obtida ainda não pode ser usada como ferramenta de combate a picadas por mosquitos no interior de residências. Pelo contrário, esse uso poderia ser um risco maior a transmissão da malária, pois contribuiria para atração dos mosquitos.

De uma forma geral o trabalho chama a atenção para uma estratégia que pode ser empregada no combate à malária e outras doenças transmitidas por insetos.  Mais uma arma, que pode ser utilizada em conjunto com outras nessa batalha épica. Por enquanto continuamos perdendo...

Ilustração do artigo "Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans".

Zwiebel LJ, & Takken W (2004). Olfactory regulation of mosquito-host interactions. Insect biochemistry and molecular biology, 34 (7), 645-52 PMID: 15242705

Okumu FO, Killeen GF, Ogoma S, Biswaro L, Smallegange RC, Mbeyela E, Titus E, Munk C, Ngonyani H, Takken W, Mshinda H, Mukabana WR, & Moore SJ (2010). Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans. PloS one, 5 (1) PMID: 20126628