Mycobacterium tuberculosis inibe apoptose neutrofílica levando ao atraso na ativação de células T CD4 naive

Post de Sarah Falcão

M. tuberculosis possui diferentes estratégias para eliminar a resposta imune. Uma destas é a modulação da apoptose da célula hospedeira. Alguns componentes isolados de M. tuberculosis tem mostrado induzir apoptose em macrófagos. Contudo, linhagens virulentas também possuem mecanismos anti-apoptóticos.

O gene nuoG de M. tuberculosis codifica uma subunidade do complexo desidrogenase NADH tipo I, que é necessária para supressão de ROS, formada pelo complexo NOX2 do macrófago hospedeiro e, assim, impede a indução de apoptose mediada por TNF.

Assim, neste trabalho visou-se estudar o efeito da M. tuberculosis sobre a apoptose do PMN e avaliar as conseqüências desse efeito na resposta imune adaptativa. Para atingir esse objetivo, um grupo de camundongos B6 foram infectados com baixa dose de uma linhagem de M. tuberculosis mutante nuoG-deficiente, e portanto, pró-apoptótica e, um outro grupo, foi infectado pelo tipo selvagem M. tuberculosis H7Rv capaz de inibir a apoptose celular. Após 14,15 e 17 dias de infecção, por citometria de fluxo, foi observado que PMNs, DCs, macrófagos alveolar e recrutados, infectados com linhagem de M. tuberculosis nuoG-deficiente, apresentaram maior ativação de caspase-3, confirmando dados anteriores in vitro. Entretanto, não foi observada diferença na carga bacteriana do pulmão dos animais infectados com as distintas linhagens de M. tuberculosis. Em seguida, os animais foram infectados com as duas linhagens WT e nuoG-deficiente expressando GFP, as células GFP+ foram separadas por sorting, e o número de bactérias por células foram contadas manualmente com auxílio de microscópio de fluorescência. PMNs, DCs e macrófagos alveolares infectados com a linhagem selvagem apresentaram maior número de bactérias por células que os animais infectados com a linhagem nuoG-deficiente. Contudo, essas células infectadas com nuoG-deficiente apresentaram maior porcentagem de células infectadas, a maioria com apenas uma bactéria.

Como mecanismos imunes inatos são insuficientes para controlar a infecção progressiva e é, então, requerida resposta Th1 CD4 e linfócitos T CD8 contra antígenos M. tuberculosis, a carga bacteriana no linfonodo mediastinal foi acessada. Os animais infectados com a linhagem selvagem mostraram menor carga, indicando que esta linhagem induz o atraso do transporte de bactéria para o linfonodo. Para comparar a ativação de células T CD4 em animais infectados com as duas linhagens, foi feita transferência adotiva, um dia antes da infecção, de antígenos de M. tuberculosis específicos para TCR de células T CD4 marcados com CFSE e, 14 dias após a infecção, por citometria de fluxo, a ativação de células CD4 foi identificada pela expressão de CD69. Os animais infectados com a linhagem nuoG-deficiente, tiveram maior porcentagem de células T CD4 ativadas e o mesmo foi observado quanto a proliferação dessas células. Contudo, 17 dias após a infecção, não houve diferença na ativação e proliferação de células T CD4 infectadas com ambas as linhagens, indicando que a M. tuberculosis selvagem apenas induz um atraso na ativação e proliferação de linfócitos T CD4. Para avaliar se o aumento da apoptose de PMN poderia contribuir para os fenômenos até aqui observados, PMNs infectados com a linhagem nuoG-deficiente foram depletados 8 dias após a infecção. Quatorze dias após a infecção, a carga bacteriana no linfonodo diminuiu com a depleção de PMNs, assim como a proliferação de células T CD4.

Como esses resultados pode-se concluir que M. tuberculosis induz um atraso no transporte de bactéria para o linfonodo, na ativação e proliferação de linfócitos T CD4. Além disso, a inibição da apoptose de PMNs contribui para o retardo da ativação de linfócitos T CD4. Por fim, este trabalho, sugere que uma vacina que aperfeiçoe a interação entre os distintos tipos de células fagocíticas possa ter uma maior eficácia que a vacina BCG já existente.

Blomgran R, Desvignes L, Briken V, & Ernst JD (2012). Mycobacterium tuberculosis Inhibits Neutrophil Apoptosis, Leading to Delayed Activation of Naive CD4 T cells. Cell host & microbe, 11 (1), 81-90 PMID: 22264515

Células dendríticas pulmonares CD103+ adquirem e apresentam antígenos associados às células apoptóticas

Post de Sarah Falcão (LIP-CPqGM/FIOCRUZ)

Três tipos de DCs foram descritas no pulmão: plasmocitóides e DCs migratórias, CD103+ ou CD11bhi. A célula dendrítica CD103+ pode apresentar antígenos no MHC classe I, de forma cruzada, enquanto que a DC CD11bhi apresenta via MHC classe II. Além disso, sabe-se que DC CD103+ é requerida para induzir a resposta CTL a vírus, contudo, ainda é desconhecido como o vírus é adquirido para apresentação.
DCs podem capturar vírus diretamente ou pela ingestão de células infectadas como células epiteliais que estejam morrendo. Ademais, há evidências indicando que DCs CD103+ da pele capturam células apoptóticas. Entretanto, já foi demonstrado que nem todos os tipos de DCs migram para o LN drenante quando injetadas ,por exemplo, na pele. Assim, o objetivo deste trabalho é identificar que população de DC migratória é capaz de adquirir células apoptóticas no tecido, para posterior apresentação do antígeno no LN do pulmão (lung-draining LN/LLN). Após injetar timócitos apoptóticos marcados com CFSE, foi observada a presença de DCs migratórias (CD11c+MHCII+) CD103+ expressando CFSE no LN. Portanto, as células apoptóticas foram preferencialmente fagocitadas pelas células DCs CD103+ e estas, em seguida, migraram para o LN. Após injetar células apoptóticas juntamente com beads de látex, foi observado que DCs CD103+ capturam células apoptóticas somente ou células apoptóticas juntamente com as beads, enquanto que as células CD11bhi apenas fagocitaram beads. Posteriormente, os autores decidiram comparar a capacidade de captura de células apoptóticas com DCs CD8+ e, observaram que células DCs CD103+ do pulmão transportam menos células apoptóticas para o LN do que DCs CD8+ no baço. Contudo, entre as DCs presentes no pulmão, as DC CD103+ são especializadas em capturar células apoptóticas e transportar para o LN. Seguindo a mesma estratégia, mas com animal Batf3-/-, que não apresenta DCs CD8+, os autores mostraram que as DCs CD103+ também não estavam presentes e, na sua ausência, não foi detectada a presença de CFSE no linfonodo, indicando que não houve migração de DCs para o LLN. Para identificar que população de linfócitos reconhece os antígenos apresentados pelas DCs CD103+, animais WT ou Batf3-/- receberam células de animais OT-1 e OT-2 (1:1), específicas para OVA marcadas com CFSE. Após 1 dia, timócitos apoptóticos expressando OVA foram injetados. Três dias após, a proliferação desses linfócitos foi avaliada e, no animal WT, observou-se a proliferação de células de camundongo OT-1, que apenas possui linfóticos T CD8. Entretanto, no animal Batf3-/-, não houve proliferação de linfócitos, indicando que células CD103+ apresentam antígenos associados com células apoptóticas que são reconhecidos por linfócitos T CD8. Avaliando a expressão de mRNA nas células CD103+ e CD11bhi, os autores observaram que somente DCs CD103+ apresentavam TLR3. Assim, eles trataram com Poli I:C, um agonista do TLR3 e observaram que a produção de IFN-g aumentou. Assim, neste trabalho, podemos concluir que DCs CD103+ do pulmão preferencialmente migram para o LLN e apresentam antígenos associados às células apoptóticas. Esses antígenos, por sua vez, são reconhecidos por linfócitos T CD8, via MHC classe I. Por fim, DCs CD103+ seletivamente expressam TLR3.

Desch AN, Randolph GJ, Murphy K, Gautier EL, Kedl RM, Lahoud MH, Caminschi I, Shortman K, Henson PM, & Jakubzick CV (2011). CD103+ pulmonary dendritic cells preferentially acquire and present apoptotic cell-associated antigen. The Journal of experimental medicine, 208 (9), 1789-97 PMID: 21859845

TRAIL regula a apoptose neutrofílica e aumenta a resolução da inflamação

Post de Sarah Falcão (LIP-CPqGM/FIOCRUZ)

A resolução da inflamação aguda requer que neutrófilos (PMNs) recrutados sejam submetidos à morte celular programada por apoptose. Entretanto, a vida dos PMNs pode ser prolongada nos tecidos, devido ao atraso da apoptose nos sítios de inflamação pelos estímulos pro-inflamatórios. Além dos receptores de morte FasL e TNF-a, responsáveis por induzir apoptose, há o TRAIL que induz apoptose para eliminar PMNs senescentes e circulantes, sem que haja ativação de NF-kB in vitro ou os efeitos quimioatraentes do FasL. TRAIL é uma proteína de membrana tipo II, expressa principalmente em leucócitos. Em humanos, TRAIL interage com 4 receptores de membrana, TRAIL-R1 e R2 que ativam caspase e NF-kB, enquanto que TRAIL-R3 e R4 têm domínios de morte truncado e não ativam caspases, mas podem ativar NF-kB.

Este trabalho visou determinar o potencial da sinalização via TRAIL em modular a apoptose neutrofílica, durante uma inflamação caracterizada pela presença maciça de PMNs. Com este intuito, foram utilizados dois modelos: dano agudo pulmonar mediado pelo LPS e peritonite induzida por zymozan. Inicialmente, PMNs obtidos de sangue periférico de animais B6 WT e TRAIL deficientes, receberam doses de TRAIL exógeno e foi visto, in vitro, por microscopia, um aumento da porcentagem de apoptose após 6 e 18hs de incubação em ambas linhagens. Após a indução de inflamação pela infiltração de LPS e, posterior lavagem bronco-alveolar, foi mostrado um aumento do número células totais após 48hs no animal TRAIL deficiente, assim como, o número total e a porcentagem de PMN. Entretanto, a porcentagem de apoptose foi significantemente maior nos animais WT e o mesmo foi observado quanto à expressão de Anexina V. A apoptose foi também quantificada usando marcação TUNEL e, mais uma vez, a apoptose foi menor nos animais TRAIL deficientes.

No modelo de peritonite, induzida pelo zymozan, foi identificada uma significante diminuição da porcentagem de PMNs apoptóticos após 24 e 48hs no animal TRAIL deficiente. Em experimentos in vivo, 6hs após o tratamento com zymozan, foi injetado TRAIL exógeno e, após 24hs, o número de PMNs e contagens da apoptose foram acessados. O tratamento com TRAIL, levou à diminuição do número de PMNs e porcentagens de células apoptóticas em animais TRAIL deficientes e WT. Esses dados demonstram que TRAIL é responsável pela indução de apoptose dos PMNs, contribuindo para a resolução da inflamação e, além disso, sugere que TRAIL pode ser utilizado no tratamento da inflamação pulmonar e sistêmica.

McGrath EE, Marriott HM, Lawrie A, Francis SE, Sabroe I, Renshaw SA, Dockrell DH, & Whyte MK (2011). TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) regulates inflammatory neutrophil apoptosis and enhances resolution of inflammation. Journal of leukocyte biology PMID: 21562052

IL-32: proteção ou exacerbação da patogênese na infecção por M. tuberculosis?

Post de Theolis Barbosa Bessa

A apoptose de macrófagos infectados por Mycobacterium tuberculosis parece ser um importante mecanismo de defesa contra o bacilo. As bactérias liberadas das células pouco responsivas podem dessa forma ser disponibilizadas para fagocitose e destruição intracelular por macrófagos ativados recrutados para o local de infecção. Corroborando essa hipótese, a capacidade de inibição da apoptose dos macrófagos hospedeiros tem sido relacionada à virulência de micobactérias (Velmurugan et al. 2007). A indução de apoptose em macrófagos infectados por M. tuberculosis está associada à sinalização pelos receptores toll-like 2 e 4, e à produção de TNF (Sánchez et al. 2009) e de superóxido (Hinchey et al. 2007). 

A IL-32 é uma citocina pró-inflamatória produzida por linfócitos T, células NK, monócitos e células epiteliais, sendo estas últimas a fonte predominante da citocina. Ela é encontrada em 4 variantes de splicing (IL-32α, IL-32β, IL-32δ e IL-32γ), sendo mais abundante o transcrito IL-32α. Sua produção é estimulada por IFN-γ e essa citocina tem como efeito o aumento da produção de IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF. A IL-32 aparentemente não é secretada; sua liberação ocorreria apenas por morte celular. A liberação de IL-32 tem sido associada à indução de apoptose e à amplificação da inflamação nas doenças inflamatórias crônicas do intestino e na artrite reumatóide, além da infecção tuberculosa (Andoh et al.2008).

No artigo de Bai e colaboradores (2010) os autores demonstram que na infecção de células humanas de linhagem macrofágica THP-1 com M. tuberculosis a IL-32 tem papel na indução de apoptose, que é pelo menos em parte mediada pela caspase 3. A inibição da produção de IL-32 também foi associada à grande diminuição da produção de TNF e ao aumento da carga bacilar nos macrófagos infectados, sugerindo um papel direto da IL-32 e da apoptose no controle do bacilo. Cabe ressaltar, no entanto, que a IL-32 também foi implicada na apoptose de linfócitos T induzida por ativação (Goda et al. 2006), e elevada apoptose destas células em indivíduos com tuberculose ativa foi associada à anergia nestes pacientes (Abebe et al. 2010). Como observado na literatura em relação ao TNF, é possível que a IL-32 tenha papel dual na infecção por M. tuberculosis, estando implicada tanto na proteção quanto na exacerbação da doença.

Bai, X., Kim, S., Azam, T., McGibney, M., Huang, H., Dinarello, C., & Chan, E. (2010). IL-32 Is a Host Protective Cytokine against Mycobacterium tuberculosis in Differentiated THP-1 Human Macrophages The Journal of Immunology, 184 (7), 3830-3840 DOI: 10.4049/jimmunol.0901913

Journal Club de Theo: Phagocytosis of Apoptotic Cells by Neutrophil Granulocytes

Vejam o material apresentado por Theo Araujo no journal club hoje.



Esmann, L., Idel, C., Sarkar, A., Hellberg, L., Behnen, M., Moller, S., van Zandbergen, G., Klinger, M., Kohl, J., Bussmeyer, U., Solbach, W., & Laskay, T. (2009). Phagocytosis of Apoptotic Cells by Neutrophil Granulocytes: Diminished Proinflammatory Neutrophil Functions in the Presence of Apoptotic Cells The Journal of Immunology, 184 (1), 391-400 DOI: 10.4049/jimmunol.0900564

Anticorpos contra linfócitos apoptóticos alteram a resposta do macrófago ao Trypanosoma cruzi

Novo trabalho do grupo de George dos Reis, com participação de Valéria Borges (LIMI) dentre outros colaboradores, acaba de ser publicado: “Apoptotic lymphocytes treated with IgG from Trypanosoma cruzi infection increase TNF-a secretion and reduce parasite replication in macrophages” (Fabricio Montalvao, Geisy M. Almeida, Elisabeth M. Silva, Valeria M. Borges, Rita Vasconcellos, Christina M. Takiya, Marcela F. Lopes, Marise P. Nunes and George A. DosReis. Eur. J. Immunol. 2010. 40: 417–425 DOI 10.1002/eji.200939606).

A infecção pelo Trypanosoma cruzi leva à produção de anticorpos contra o parasita, mas também contra moléculas do hospedeiro. O grupo já havia demonstrado que a fagocitose de linfócitos apoptóticos leva à exacerbação da replicação do T. cruzi em macrófagos, em um processo dependente da produção de PGE2 e de TGF-b1 (Freire-de-Lima et al., Nature, 2000).  O estudo agora publicado explora a possibilidade que anticorpos contra linfócitos apoptóticos possam ter um papel protetor durante a infecção por T. cruzi ajudando no controle da replicação do parasita por macrófagos.

Eles demonstram que existem anticorpos IgG capazes de opsonizar linfócitos apoptoticos tanto no soro de camundongos controles como nos chagásicos. Porém, apenas a opsonização feita com anticorpos do soro de animais infectados reduziu a replicação do T. cruzi nos macrófagos. Em relação às culturas tratadas com linfócitos apoptóticos sem opsonização ocorreu redução da produção de TGF-b1 e aumento da produção de TNF-a pelos macrófagos infectados. Este aumento da produção de TNF-a está diretamente implicado na ativação do macrófago e redução da carga parasitária.

Um dado muito interessante foi obtido in vivo. A preimunização com linfócitos apoptóticos ou a injeção de linfócitos apoptóticos opsonizados com IgG chagásica levou a uma redução da parasitemia de camundongos.

Os elegantes dados apresentados pelo grupo do Prof. dosReis ilustram o cuidado que todos devemos ter ao interpretar dados científicos. A adição de anticorpos ao sistema que incluía macrófagos infectados pelo T. cruzi e linfócitos apoptóticos leva a uma resposta totalmente diferente da encontrada na ausência de anticorpos. É possível, que o aumento da complexidade do sistema pela introdução de outros elementos leve a novas conclusões. Ou seja, a abordagem reducionista experimental é essencial ao progresso da compreensão de sistemas altamente complexos como os envolvidos na resposta imune, mas suas respostas devem ser tomadas com cautela.

Este estudo é também um bom exemplo de mecanismo de proteção imune mediado por anticorpos, mas efetuado pelo braço celular da reposta imune, avançando na eliminação das fronteiras entre os antigos campos da imunologia.

Montalvão, F., Almeida, G., Silva, E., Borges, V., Vasconcellos, R., Takiya, C., Lopes, M., Nunes, M., & DosReis, G. (2010). Apoptotic lymphocytes treated with IgG from infection increase TNF-α secretion and reduce parasite replication in macrophages
European Journal of Immunology, 40 (2), 417-425 DOI: 10.1002/eji.200939606