IL-32γ Induz Maturação de Células Dendriticas com Capacidade de Polarização Th1 e Th17 através da Produção Aumentada de IL-12 e IL-6

Post de Natalia Machado

As células dendriticas (DCs) atuam nos tecidos como sentinelas. Após sinal de perigo/maturação, estas células sofrem maturação e migram para os órgãos linfoides secundários, onde apresentam antígeno e estimulam células T. Maturação e ativação das DCs tem papel central entre resposta imune inata e adaptativa. Porém, o papel da IL-32 nestes processos e na sua capacidade em polarizar células T CD4 não é claro.

Inicialmente os autores trataram DCs derivadas da medula óssea com IL-32γ e observaram, por FACS, um aumento dose-dependente de MHC-II, CD86 e CD40. Além disso, a expressão de genes relacionados à maturação de DCs foi avaliada por RT-PCR. A expressão gênica de IL-6, IL-1β e TNF-α estavam significativamente aumentadas, enquanto a de TGF-β não foi alterada. A expressão de IL-12, IL-23 e IL-27 também estavam aumentadas na presença de IL-32γ de modo dose-dependente. Resultados similares foram obtidos por ELISA, com exceção da IL-10 que também foi induzida na presença de IL-32. Para confirmar funcionalmente a indução de maturação, a capacidade endocitica das DCs foi avaliada. Os resultados mostram que o percentual de DCs dextran-FITC positivas é menor naquelas tratadas com IL-32, indicando que houve indução de maturação funcional destas células.

Para esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na maturação e ativação das DCs, as células foram tratadas com inibidores de cinases sinalizadoras e NF-κB antes da incubação com IL-32γ. A produção de IL-12 e IL-6 foram significativamente reduzidas com inibidores de PLC, JNK e NF-κB. No entanto, a inibição de p38 também inibiu a produção de IL-6, indicando que outras vias podem regular sua produção.

Em seguida, os autores avaliaram se IL-32γ induz maturação de DCs em APC funcionais. Para isso, células T CD4+ foram isoladas de camundongos BALB/c (I-Ad) e cultivadas com DCs de C57BL/6 (I-Ab) tratadas com IL-32γ. Os resultados mostram que DCs tratadas com IL-32γ estimularam resposta proliferativa mais eficientemente do que células controles não tratadas e em níveis similares às DCs tratadas com LPS. Além disso, o tratamento de DCs com IL-32γ aumentou de modo significativo o percentual de células T CD4+ expressando IL-2. A produção de IFN-γ, bem como o percentual de células produzindo IFN-γ, também estavam aumentados nas co-culturas com DCs tratadas com IL-32γ. Nestas culturas, foram observadas expansão e ativação de células Th17. A produção de IL-4 não foi alterada. Com a neutralização de IL-12p40 por anticorpo, a produção de IFN-γ foi significativamente reduzida.





Para confirmar se IL-6, IL-1β, IL-21 e IL-23 derivadas de DCs tratadas com IL-32γ estavam envolvidas na diferenciação de células Th17, os autores usaram anticorpos neutralizantes específicos para cada citocina. O bloqueio de IL-1β ou IL-6 reduziu a produção de IL-17 por células T CD4+ co-cultivadas. A neutralização de IL-21 ou IL-23 não teve efeito.

Por fim, os autores transferiram DCs tratadas com IL-32γ para camundongos sensibilizados com OVA. Os resultados mostram que a injeção de DCs aumenta a produção de IFN-γ e IL-17, mas não de IL-4. As populações Th1 e Th17 estavam aumentadas nos animais que receberam as DCs tratadas. Os resultados obtidos neste estudo mostram que DCs estimuladas com IL-32γ podem modular a polarização Th1 e Th17 tanto in vitro quanto in vivo.

O grupo conclui que IL-32γ parece funcionar como mediador de maturação e ativação de DCs, resultando na produção aumentada de IL-12 e IL-6, citocinas polarizadoras Th1 e Th17, via PLV/JNK/NF-κB. Estes resultados podem explicar o papel da IL-32 na resposta imune inata e adaptativa que pode ser relevante para a patogênese de doenças inflamatórias.

Referência:

Jung MY, Son MH, Kim SH, Cho D, & Kim TS (2011). IL-32gamma Induces the Maturation of Dendritic Cells with Th1- and Th17-Polarizing Ability through Enhanced IL-12 and IL-6 Production. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) PMID: 21551364

As células T CD4 possuem papel importante na diferenciação de células dendríticas inflamatórias a partir de monócitos

Post de Natália Machado




As células dendríticas (DCs) são fundamentais para a geração de resposta imune e são compostas por muitos subtipos. Em homeostasia, são as convencionais residentes e migratórias, as plasmocitóides e as de Langerhans. Após estimulo inflamatório, monócitos são recrutados e diferenciam em DC de modo dependente de GM-CSF. Embora muitas células linfóides e mielóides produzam GM-CSF in vitro, ainda não está claro qual a fonte desta citocina in vivo. O trabalho de Campbell e colaboradores [1] mostra de forma elegante a participação de células T CD4 na diferenciação das células dendríticas inflamatórias no modelo experimental de artrite.

Os autores estavam estudando o mecanismo de proteção contra a artrite em camundongos deficientes em NF-κB1 (Nfkb1-/-), mas não em c-Rel1 (Rel-/-), que em trabalho anterior eles demonstraram ser dependente de células T CD4 [2]. Eles transferiram células T CD4 esplênicas de camundongos WT, Il1r-1-/- ou Nfkb1-/- para Rag1-/-, e verificaram que nos camundongos que receberam células Nfkb1-/- não houve indução de artrite, diferentemente daqueles que receberam células T CD4 WT ou Il1r-1-/-. Apesar de que nos animais Nfkb1-/- a morte de células T CD4 por apoptose é maior do que a observada nos animais WT (uma vez que Rel/NF-κB é importante para sobrevivência celular por inibir apoptose) os autores demonstraram que em camundongos Nfkb1-/- transgênicos para Bcl2 em todos os leucócitos houve redução na apoptose de células T CD4 in vitro, porém manteve-se a inibição da artrite. Isto sugere que a sobrevivência das células T CD4 não é o mecanismo de proteção nos animais Nfkb1-/-.

Ao avaliar os efeitos da deficiência em NF-κB1 na expressão de marcadores de ativação, receptores e produção de citocinas, os autores verificaram expressão normal de CD25, CD69 e IL-17, porém aumentada de IL-2 e diminuída de GM-CSF, coincidente com menores níveis desta citocina no sobrenadante das culturas de células T CD4 estimuladas. Confirmando a importância deste último achado para o desenvolvimento da doença, a transferência de células T CD4 de animais GM-CSF-/- para Rag-/- levou a redução significativa da artrite, e a injeção de GM-CSF restaurou completamente a resposta dos animais Nfkb1-/- em todos os aspectos da doença. In vivo, no tecido sinovial inflamado e no linfonodo poplíteo drenante de animais WT, uma elevada proporção da população de células CD11c+ era constituída por dendríticas derivadas de monócitos, mas sua quantidade estava reduzida no linfonodo de animais GM-CSF-/-.






Animais depletados para CD11c(hi) foram utilizados para estabelecer a importância das DCs neste modelo. A doença foi significativamente reduzida nestes camundongos, mas alguma artrite residual estava presente. Para avaliar o papel do NF-κB, DCs de animais Nfkb1-/- foram utilizadas in vitro para MLR alogênico OVA-específico. Os resultados obtidos mostram que DCs Nfkb1-/- são similares às WT. No entanto, quando animais OT-II foram cruzados com animais Nfkb1-/-, OVA-específicos, as células T CD4 Nfkb1-/- não responderam ao estímulo in vitro com DCs esplênicas carregadas com OVA. Os autores também demonstraram a importância dos mesmos achados em outro modelo experimental, de indução de peritonite.

Os autores, com base nos achados mais relevantes deste estudo, concluem que NF-κB1 tem papel fundamental na produção de GM-CSF por células T CD4 ativadas durante resposta inflamatória. Além disso, GM-CSF produzido por estas células induz o desenvolvimento preferencial de DCs derivadas de monócitos.


Referências:

[1] Campbell IK, van Nieuwenhuijze A, Segura E, O'Donnell K, Coghill E, Hommel M, Gerondakis S, Villadangos JA, & Wicks IP (2011). Differentiation of Inflammatory Dendritic Cells Is Mediated by NF-{kappa}B1-Dependent GM-CSF Production in CD4 T Cells. J Immunol

[2] I.K. Campbell, S. Gerondakis, K. O’Donnell, I.P. Wicks, Distinct roles for the NF-kappaB1 (p50) and c-Rel transcription factors in inflammatory arthritis, J. Clin. Invest. 105 (2000) 1799-1806.

PPAR gama modulated inflammatory response of human dendritic cell subsets to engulfed apoptotic neutrophils

Post de Sarah Falcão, LIP/CPqGM-FIOCRUZ

Neutrófilos (PMNs) circulantes são recrutados em largo número ao sítio de infecção, onde exercem funções efetoras para eliminar patógenos e/ou células deterioradas. Durante a resolução da inflamação, neutrófilos morrem através de apoptose espontânea, liberando sinais que induzem células vizinhas, como macrófagos e células dendríticas (DCs), a fagocitarem esses neutrófilos apoptóticos. As DCs, após internalizarem células mortas, transportam antígenos adquiridos dos neutrófilos apoptóticos para o linfonodo drenante, onde apresentam esses antígenos e, por sua vez, ativam os linfócitos, direcionando a imunidade adaptativa. Estudos anteriores, identificaram duas linhagens de DCs, a CD1a+, que não expressa CD14 e que expressa fracamente o receptor PPAR gama, e as células CD1a-, que são CD14lowPPRAgamahigh. Já foi descrito na literatura que o PPARgama é altamente regulado durante o programa de maturação de monócito-macrófagos e foi implicado na regulação de uma resposta anti-inflamatória na fagocitose de células apoptóticas. Portanto, neste trabalho, os autores buscaram caracterizar os efeitos da fagocitose dos neutrófilos apoptóticos pelas linhagens de células dendríticas CD1a+ ou CD1a-, relacionando isso com a expressão do receptor PPARgama. Com esse propósito, utilizaram DCs obtidas de PBMC humano, co-cultivaram com neutrófilos apoptóticos obtidos do sangue periférico e, por citometria de fluxo, mostraram que a fagocitose de PMNs apoptóticos foi maior com a presença de um ativador transcricional do gene para o receptor PPARgama, o ligante sintético RSG. Além disso, as células CD1a- têm maior capacidade de fagocitar PMNs apoptóticos. Após o co-cultivo com PMNs(apop), as DCs tiveram a expressão de CD209 ou DC-SIGN (DC-SIGN é uma lectina tipo C, que liga-se a patógenos e pode atuar como molécula de adesão) diminuídas e, essa diminuição foi ainda maior na presença de RSG. Com o bloqueio do CD209 houve uma diminuição da fagocitose de PMNs apoptóticos, sugerindo que DC-SIGN está envolvida no processo de internalização celular. Ainda, a fagocitose de PMNs apoptóticos induziu a ativação das duas linhagens celulares de DCs, CD1a- e CD1a+, que foi evidenciado pelo aumento da expressão de CD83 após co-cultivo das DCs com PMNs(apop).

DCs incubadas com PMNs apoptóticos e tratadas com LPS e IFN-gama, secretaram as citocinas inflamatórias IL-8, IL-6, IL-12 e TNF-a. Entretanto, células da linhagem CD1a- produziram maiores quantidades de TNF-a e IL-6 que as da linhagem CD1a+. Contudo, na presença do agonista RSG, houve uma diminuição da produção dessas citocinas. Por sua vez, as células que fagocitaram os PMNs(apop) foram a principal fonte dessas citocinas pró-inflamatórias. Para avaliar o efeito da fagocitose de PMNs apoptóticos pelas DCs na ativação de linfócitos e indução da resposta adaptativa, DCs inicialmente co-cultivada com PMNs(apop) foram incubadas com linfócitos T, mostrando um aumento da produção de IFN-y, diferente do que foi visto no co-cultivo com macrófagos. Além disso, essa produção foi maior no cultivo com as células dendríticas CD1a+. Entretanto, células CD1a-, na ausência de RSG, apresentaram maior produção de IFN-gama, demonstrando assim o papel regulador e anti-inflmatório da PPRA-gama. Assim, neste trabalho, podemos concluir que as DCs CD1a- têm maior capacidade de fagocitar células apoptóticas e o receptor PPRA-gama, altamente expresso na célula CD1a-, exerce um papel anti-inflamatório. Por fim, os autores sugerem que o papel regulador do PPARgama na diferenciação de DCs e na sua capacidade fagocítica, assim como sua habilidade de modular a resposta imune celular, pode ter impacto no desenvolvimento de terapias imunes associadas com a internalização de células apoptóticas.

Majai, G., Gogolak, P., Ambrus, C., Vereb, G., Hodrea, J., Fesus, L., & Rajnavolgyi, E. (2010). PPAR gama  modulated inflammatory response of human dendritic cell subsets to engulfed apoptotic neutrophils Journal of Leukocyte Biology, 88 (5), 981-991 DOI: 10.1189/jlb.0310144

Natália Machado: Células dendríticas em vacinas, no SBI2010

Post de Natália Machado

No segundo dia de congresso, a palestra do Ken Shortman intitulada “Enhancing the effectiveness of vaccines by targeting antigens to dendritic cells” foi, realmente, muito boa.

Enfatizando a importância do estagio de maturação das células dendriticas para a indução da resposta imune, Shortman ressaltou que células dendriticas imaturas induzem tolerância, enquanto aquelas maduras, imunidade.

Logo em seguida, ao afirmar que aqueles que não trabalham com células dendriticas podem não entender a caracterização dos subtipos destas células; aqueles que trabalham, tampouco compreendem bem esse tema, me deixou mais tranqüila. Na tentativa de esclarecer, Shortman citou a divisão entre células dendriticas steady-state convencionais e plasmocitoides, além das diferentes características entre elas. As primeiras são classificadas entre migratórias e residentes de tecidos linfóides. No caso das migratórias, a divisão é baseada no tecido periférico de origem: as de Langerhans epidérmicas e as da derme. Já as residentes de tecidos linfóides murinas podem ser classificadas de acordo com a expressão de CD8α. Por fim, as células dendriticas inflamatórias que surgem como conseqüência de infecção ou inflamação. 

Outro ponto da apresentação foram os diferentes marcadores de superfície entre células dendriticas murinas e humanas. As murinas maduras expressam CD11c, CD80, CD86, CD40 além de níveis moderados a altos de MHC-II. CD4 e CD8 também são expressos em células dendriticas murinas, além do CD11b e CD205. Um divisor na comparação entre células dendriticas murinas e humanas é a ausência do CD8α nas humanas.  No entanto, estas células expressam CD1a, CD11c, CD4, CD11b^lo, CD141 e MHC-II^hi.

Finalmente, Shortman relembra que células dendriticas já têm sido utilizadas clinicamente na imunoterapia do câncer. Neste sentido, as células dendriticas são geradas in vitro a partir de monócitos do paciente, carregadas com antígeno e injetadas de volta. Trata-se de uma célula dendritica inflamatória que induz uma resposta imune mais efetiva.

Uma questão importante neste sentido é a seleção da molécula de superfície que servira como alvo para a entrega do antígeno. Shortman cita exemplos como a Clec9A que é semelhante a uma lectina do tipo C seletivamente expressa em células dendriticas CD8+ e plasmocitoides. Usando anticorpos monoclonais contra Clec9A, eles induziram aumento na imunidade humoral e na proliferação de células T na ausência de adjuvantes. Novamente, ele relembra que células dendriticas “semi-maduras” são diferentes das completamente ativadas. Diante da não-ativação das células dendriticas CD8+ após a administração do anticorpo contra Cle9A, surge a pergunta sobre a necessidade de utilizar outras moléculas-alvo em conjunto com o objetivo de induzir a ativação das células dendriticas. 

Encerrando a palestra, Shortman cita outras lectinas do tipo C expressas em células dendriticas como a DC205 do tipo I e a Clec12A do tipo II.

Células dendríticas. Nada como d’antes no quartel de Abrantes.

Post de Cecília Favali

Sabe-se que em resposta aos estímulos inflamatórios as células dendríticas (DCs) passam por alterações morfológicas e funcionais que caracterizam o processo de maturação.  Tal processo é necessário para que ocorra um estímulo eficiente dos linfócitos T nos órgãos linfóides secundários. Uma característica até então estabelecida da maturação das DCs é a diminuição a capacidade de capturar antígenos, especialmente por endocitose mediada por receptor, e fagocitose. Porém, as DCs maturas continuam a formar vesículas recobertas por clatrina sugerindo que tal internalização parece continuar a ocorrer. 

No artigo de Platt e colaboradores (Mature dendritic cells use endocytic receptors to capture and present antigens), o grupo utiliza sistemas de internalização de imunocomplexos via FcRγ e de antígenos associados a anticorpos anti DEC205 em DCs murinas derivadas da medula óssea em belíssimos registros em microscopia confocal. A taxa de internalização e de localização posterior nos compartimentos endocíticos tardios era a mesma em DCs maturas e imaturas sendo aparentemente menos eficiente em DCs maturas. A fagocitose de “beads” cobertas por IgG também não era diferente entre as DCs. Quando expostas a OVA dirigida aos receptores, as DCs maturas eram ainda mais eficientes que as DCs imaturas quanto ao no estímulo de linfócitos T. Uma maior expressão de moléculas coestimulatórias não justificaria tal diferença por ser utilizado um sistema artificial de coestimulação. As DCs maturas também foram eficientes na formação dos complexos MHC- antígeno após internalização mediada por  clatrina ou por fagocitose. 

Num “passado recente” as DCs maturas não apresentavam a capacidade de realizar apresentação cruzada devido a diminuição de internalização de antígenos exógenos. Pois bem, para fechar com chave de ouro, os autores demonstram que as DCs maturas apresentam sim de forma cruzada os antígenos internalizados via receptor, mais eficientemente que as DCs imaturas. E ainda, apresentam uma “reserva” lisossômica de MHC classe II que permite a apresentação dos antígenos e o estímulo de linfócitos T. Fechando o artigo, experimentos in vivo foram realizados e resultados similares foram obtidos. 

Depois dos basófilos apresentando antígenos (Sokol, 2009), agora é o fim dos slides de introdução com “o processo de maturação das DCs se caracteriza por uma diminuição na captura dos antígenos”. Está cada vez mais difícil ser professor de Imunologia nos dias de hoje!

Ilustração.

Platt, C., Ma, J., Chalouni, C., Ebersold, M., Bou-Reslan, H., Carano, R., Mellman, I., & Delamarre, L. (2010). Mature dendritic cells use endocytic receptors to capture and present antigens Proceedings of the National Academy of Sciences DOI: 10.1073/pnas.0910609107

Sokol, C., Chu, N., Yu, S., Nish, S., Laufer, T., & Medzhitov, R. (2009). Basophils function as antigen-presenting cells for an allergen-induced T helper type 2 response Nature Immunology, 10 (7), 713-720 DOI: 10.1038/ni.1738