MAP kinase 10 de Leishmania major protege contra infecção experimental por L. major

Post de Sarah Falcão (LIP-CPqGM-FIOCRUZ)

Leishmania spp. pode causar desde lesões cutâneas que curam espontaneamente, a leishmaniose visceral disseminada. Há drogas liberadas para o tratamento, contudo, existe o problema da toxicidade e baixo índice terapêutico. Assim como todas as doenças infecciosas, a prevenção da leishmaniose por uma vacina profilática é superior à cura quimioterapêutica. As MAP kinases são os sinalizadores intermediários mais antigos e conservados evolutivamente e que executam papel crucial na cascata de sinalização e funções efetoras nos macrófagos. Portanto, a MAP kinase da Leishmania é um antígeno importante capaz de afetar a sinalização das células hospedeiras, sendo assim, um forte candidato à vacina. Das quinze MAP kinases da Leishmania foi escolhida a LmjMAPk10 para ser testada neste trabalho. Com esse objetivo, o gene da LmjMAPk10 foi clonado em um vetor de expressão em mamífero (pCDNA6-His A) para expressar em camundongo e um vetor de expressão (pET28a+) para purificação da proteína. Foi usada a proteína LmjMAPk10 ou o DNA sozinho ou a combinação de ambos para acessar a eficácia da proteção no modelo experimental de infecção por L. major no camundongo BALB/c.

Inicialmente, os autores viram a expressão da proteína LmjMAPk10 em formas promastigotas e amastigotas por Western blotting. Para determinar a resposta humoral específica para a proteína LmjMAPk10, camundongos BALB/c foram inoculados com LmjMAPk10 e, em seguida, foram infectados com 2x10⁶ L. major na pata. Cinco semanas após, foi observado no soro um aumento nos níveis de IgG1 e igG2a nos grupos imunizados comparado aos controles. Como IgG1 é induzido pela IL-4, uma citocina Th2 e, por sua vez, a IgG2a é induzida pelo INF-g, uma citocina Th1, esse resultado sugere que há ativação de células Th1 e Th2 simultaneamente pela imunização com a LmjMAPk10. Por isso, cinco semanas após a infecção, foi acessada a produção dessas citocinas pelas células do LN dos camundongos imunizados+infectados e do grupo controle apenas infectado.

A imunização resultou numa significante diminuição de IL-4, mas um aumento de INF-g e um pequeno aumento de IL-10. Com a mensuração da lesão foi observada a menor lesão no animal imunizado com o DNA e, em seguida, com a proteína, contudo, esses dois grupos não tiveram diferenças significantes. A carga parasitária foi reduzida em todos os grupos experimentais quando comparado com o controle, entretanto, o grupo imunizado com a proteína apresentou a menor carga parasitária, seguido pelos grupos proteína+DNA e DNA sozinho. Os resultados mostraram que a imunização com a proteína ou com o DNA apresentaram maior proteção contra a infecção por L. major e os níveis de proteção são equivalentes entre estas duas estratégias e, portanto, claramente indicam que a LmjMAPk10 é uma provável candidata à vacina.

Kumari S, Singh S, Saha B, & Paliwal PK (2011). Leishmania major MAP kinase 10 is protective against experimental L. major infection. Vaccine PMID: 21527301

IL-32γ Induz Maturação de Células Dendriticas com Capacidade de Polarização Th1 e Th17 através da Produção Aumentada de IL-12 e IL-6

Post de Natalia Machado

As células dendriticas (DCs) atuam nos tecidos como sentinelas. Após sinal de perigo/maturação, estas células sofrem maturação e migram para os órgãos linfoides secundários, onde apresentam antígeno e estimulam células T. Maturação e ativação das DCs tem papel central entre resposta imune inata e adaptativa. Porém, o papel da IL-32 nestes processos e na sua capacidade em polarizar células T CD4 não é claro.

Inicialmente os autores trataram DCs derivadas da medula óssea com IL-32γ e observaram, por FACS, um aumento dose-dependente de MHC-II, CD86 e CD40. Além disso, a expressão de genes relacionados à maturação de DCs foi avaliada por RT-PCR. A expressão gênica de IL-6, IL-1β e TNF-α estavam significativamente aumentadas, enquanto a de TGF-β não foi alterada. A expressão de IL-12, IL-23 e IL-27 também estavam aumentadas na presença de IL-32γ de modo dose-dependente. Resultados similares foram obtidos por ELISA, com exceção da IL-10 que também foi induzida na presença de IL-32. Para confirmar funcionalmente a indução de maturação, a capacidade endocitica das DCs foi avaliada. Os resultados mostram que o percentual de DCs dextran-FITC positivas é menor naquelas tratadas com IL-32, indicando que houve indução de maturação funcional destas células.

Para esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na maturação e ativação das DCs, as células foram tratadas com inibidores de cinases sinalizadoras e NF-κB antes da incubação com IL-32γ. A produção de IL-12 e IL-6 foram significativamente reduzidas com inibidores de PLC, JNK e NF-κB. No entanto, a inibição de p38 também inibiu a produção de IL-6, indicando que outras vias podem regular sua produção.

Em seguida, os autores avaliaram se IL-32γ induz maturação de DCs em APC funcionais. Para isso, células T CD4+ foram isoladas de camundongos BALB/c (I-Ad) e cultivadas com DCs de C57BL/6 (I-Ab) tratadas com IL-32γ. Os resultados mostram que DCs tratadas com IL-32γ estimularam resposta proliferativa mais eficientemente do que células controles não tratadas e em níveis similares às DCs tratadas com LPS. Além disso, o tratamento de DCs com IL-32γ aumentou de modo significativo o percentual de células T CD4+ expressando IL-2. A produção de IFN-γ, bem como o percentual de células produzindo IFN-γ, também estavam aumentados nas co-culturas com DCs tratadas com IL-32γ. Nestas culturas, foram observadas expansão e ativação de células Th17. A produção de IL-4 não foi alterada. Com a neutralização de IL-12p40 por anticorpo, a produção de IFN-γ foi significativamente reduzida.





Para confirmar se IL-6, IL-1β, IL-21 e IL-23 derivadas de DCs tratadas com IL-32γ estavam envolvidas na diferenciação de células Th17, os autores usaram anticorpos neutralizantes específicos para cada citocina. O bloqueio de IL-1β ou IL-6 reduziu a produção de IL-17 por células T CD4+ co-cultivadas. A neutralização de IL-21 ou IL-23 não teve efeito.

Por fim, os autores transferiram DCs tratadas com IL-32γ para camundongos sensibilizados com OVA. Os resultados mostram que a injeção de DCs aumenta a produção de IFN-γ e IL-17, mas não de IL-4. As populações Th1 e Th17 estavam aumentadas nos animais que receberam as DCs tratadas. Os resultados obtidos neste estudo mostram que DCs estimuladas com IL-32γ podem modular a polarização Th1 e Th17 tanto in vitro quanto in vivo.

O grupo conclui que IL-32γ parece funcionar como mediador de maturação e ativação de DCs, resultando na produção aumentada de IL-12 e IL-6, citocinas polarizadoras Th1 e Th17, via PLV/JNK/NF-κB. Estes resultados podem explicar o papel da IL-32 na resposta imune inata e adaptativa que pode ser relevante para a patogênese de doenças inflamatórias.

Referência:

Jung MY, Son MH, Kim SH, Cho D, & Kim TS (2011). IL-32gamma Induces the Maturation of Dendritic Cells with Th1- and Th17-Polarizing Ability through Enhanced IL-12 and IL-6 Production. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) PMID: 21551364

III São Paulo Advanced Immunology Graduate Course

Post de Diego Moura Santos (LIP-CPqGM/FIOCRUZ) e Nívea Farias Luz (LIMI-CPqGM/FIOCRUZ)

III São Paulo Advanced Immunology Graduate Course

III Symposium: “Research Advances and Progress in Immunology”

Aconteceu na USP, São Paulo-SP, entre os dias 16 e 18 de maio de 2011, o III Curso Avançado em Imunologia. No dia 19 do mesmo mês e ano, no mesmo local, ocorreu o III Simpósio “Research Advances and Progress in Immunology”.

O curso foi organizado pelos professores:

Dr. Lourdes Isaac, Department of Immunology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

Dr. Anderson Sá Nunes, Department of Immunology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

Dr. Ana Paula Lepique, Department of Immunology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

Dr. Mohamed R. Daha, Department of Nephrology, Leiden University Medical Center, Leiden, Netherlands

Dr. Momtchilo Russo, Department of Immunology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

1ª dia – 16/05/2011

Neste dia o tema foi o sistema complemento e imunidade inata, com palestras ministradas pelos professores Dr. Mohamed R. Daha e Dr. Jos A.G. Van Strijp. O professor Mohamed R. Daha, o qual possui uma vasta experiência na área de complemento e doenças auto-imunes renais, fez uma revisão sobre o sistema complemento e mostrou a importância deste para a defesa dos organismos. Ele também discutiu o papel do complemento na artrite em modelo experimental.

Depois foi a vez do professor Jos A.G. Van Strijp que explanou sobre a evasão do sistema imune inato por bactérias. Seu grupo foi o responsável pelo descobrimento e caracterização de proteínas bacterianas secretadas que se ligam a receptores e moléculas envolvidas na imunidade inata, bloqueando a ação desta última.

2ª dia – 17/05/2011

No segundo dia foi a vez do professor Dr. Maurício M. Rodrigues que mostrou uma parte do seu trabalho na área de vacinologia. Ele discutiu os últimos resultados obtidos pelo seu grupo com o uso de novas estratégias usando proteínas, vírus recombinantes e DNA para indução de resposta imune, a fim de induzir resistência contra infecção por Trypanosoma cruzi e Plasmodium.

Em seguida, foi a vez do professor Dr. Marcelo Barcinski, criador do conceito “mimetismo apoptótico”. Ele mostrou o papel da apoptose em patógenos unicelulares na atenuação da resposta imune, levando assim ao estabelecimento de doenças parasitárias.

3ª dia- 18/05-2011

No terceiro dia a professora Ana Paula Lepique falou a respeito da reposta imune em lesões associadas a HPV16 em camundongos e o perfil de expressão de citocinas no local da lesão.

Em seguida, o professor Miguel Soares falou sobre o controle de dano tecidual como um componente integral e essencial da imunidade. Ele discorreu sobre conceitos relevantes como homeostasia, sistema imune e imunidade, e aplicou esses conceitos no contexto de doenças infecciosas, como malária e sepse. Além disso, o professor Soares tratou sobre fatores que conferem resistência à infecção ou tolerância no hospedeiro, destacando a heme oxigenase 1 (HO-1) como um dos genes de resposta a estresse, revelado como um mediador que confere tolerância ao hospedeiro em diversos modelos experimentais.

4ª dia- 19/05/2011

Nesse dia ocorreu o simpósio, que teve como público não só os estudantes inscritos, mas também outros pesquisadores e alunos de diversos lugares do Brasil. O primeiro palestrante foi o professor Jos Strijp que falou sobre mecanismos bacterianos de evasão da imunidade inata, destacando os mecanismos da Staphylococcus como proteínas secretadas que interferem na ativação do sistema imune humano. O segundo palestrante, professor Mohamed Daha discorreu sobre a importância do sistema complemento em doenças auto-imune destacando o lúpus eritematoso sistêmico e a artrite reumatóide. Em seguida, o professor Maurício Martins falou sobre a geração de imunogenicidade de proteínas recombinantes baseadas nas diferentes formas do antígeno circunsporozoíta de Plasmodium vivax. O palestrante seguinte, professor Marcelo Barcincki falou sobre o mimetismo apoptótico do parasita na interação com o hospedeiro, destacando a participação desse fenômeno no desfecho clínico na infecção por Leishmania. Por fim, o professor Miguel Soares explanou sobre anemia falciforme no contexto da tolerância à infecção por Plasmodium, ressaltando o recente achado do seu grupo de que camundongos que têm apenas o traço falcêmico não desenvolvem malaria cerebral e esse efeito é atribuído principalmente a enzima HO-1.

No total foram 31 alunos inscritos, sendo que 9 foram estrangeiros vindos dos seguintes países: Argentina, Uruguai, Peru e Paquistão. Todos os dias, depois das palestras introdutórias ministradas pelos convidados, ocorria a divisão dos alunos em pequenos grupos para a discussão de artigos relacionados à área, seguida da apresentação dos mesmos pelos alunos. A cada dia eram feitos novos grupos, com o intuito de induzir a interação entre os estudantes e que estes se tornem futuros colaboradores no campo da ciência.

Uso de máscara e infecção respiratória entre profissionais de saúde de Pequim, China

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Fonte: H1N1: Protecting Healthcare Workers. National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) Science Blog.


Post de Sheila Sotelino da Rocha




As estratégias utilizadas para o controle do risco de disseminação de doenças infecciosas têm sido intensificadas em escala global. Entretanto, apesar dos avanços da ciência e da tecnologia em saúde, voltados para a melhoria dos processos, produtos e procedimentos de intervenção, poucos estudos são realizados nas instituições de saúde com o propósito de conhecer e avaliar a implantação de medidas destinadas a esse controle e sua aplicação na busca de melhores condutas de saúde pública.

A relevância desse artigo está no reconhecimento desse fato e da importância da sensibilização dos profissionais de saúde para a adesão a procedimentos capazes de conferir proteção não só para sua própria saúde como contribuir na contenção da transmissão de doenças nos ambientes hospitalares.

Neste estudo realizado em oito hospitais de Pequim, China, durante o inverno de 2007/2008, período de gripe sazonal naquela região, buscou-se determinar as taxas de uso de máscaras por trabalhadores de saúde, associando-se fatores relacionados a esse uso com episódios de infecção respiratória. Foram analisadas por questionário questões relativas a características demográficas, tipo de ocupação e função clínica, atitude e adesão ao uso de máscara, tipos de máscara usada, freqüência de lavagem das mãos, vacinação contra a gripe sazonal e episódios de infecções respiratórias.

A pesquisa apontou uma alta adesão ao uso de máscaras por parte dos profissionais de saúde (70%, 280/400) e atribuiu esse resultado a uma melhor consciência desses profissionais em relação a procedimentos preventivos e a um maior rigor na gestão do controle de infecções hospitalares após o surto da Síndrome Respiratória Aguda Severa (SARS) ocorrida em Pequim em 2003. Os profissionais em nível junior e intermediário apresentaram maiores taxas de adesão do que os de nível sênior (Tabela 3). O uso de máscaras e a lavagem frequente das mãos foram associadas a proteção contra a influenza (Tabela 4).

Apesar das limitações apresentadas pelo próprio estudo, inclusive o fato de se basear em informações auto-reportadas, vale ressaltar que esta foi uma primeira estimativa quantitativa relacionando procedimento de prevenção (uso de máscara) e episódio de doença (infecção respiratória) em profissionais de saúde de Pequim após o surto de SARS de 2003.

Referência:

Yang, P., Seale, H., MacIntyre, C., Zhang, H., Zhang, Z., Zhang, Y., Wang, X., Li, X., Pang, X., & Wang, Q. (2011). Mask-wearing and respiratory infection in healthcare workers in Beijing, China Brazilian Journal of Infectious Diseases, 15 (2), 102-108 DOI: 10.1590/S1413-86702011000200002

DNA from the beginning

Quando se fala em genética, por onde você começa?

Pelo começo, é claro. O site DNA from the beginning apresenta os 75 experimentos primordiais (aparentemente) que levaram ao desenvolvimento da genética moderna. O melhor: feito pelo Centro de Aprendizagem de DNA do Cold Spring Harbor cuja missão é: preparar os estudantes para sobreviver na era do gene.

O site é organizado em 3 áreas chaves: genética clássica, genética molecular e organização gênica. Cada área apresenta os conceitos chave e cada conceito tem animações, desenhos, vídeos, etc, explicando estes conceitos.

Vale a pena conferir!

Fonte: Naturally Selected

Contribuição de células T restritas ao CD1 específicas para ácidos micólicos em respostas imunes de memória

Post de Evelin Oliveira





Vários trabalhos mostram a participação das células T não convencionais que reconhecem antígenos não peptídicos na resposta imune contra o Mycobacterium tuberculosis. Em geral, estas respostas têm sido consideradas no contexto da imunidade inata, associadas ao reconhecimento de antígenos por células T gama-delta [1]. A parede celular micobacteriana contém lipídeos antigênicos que são reconhecidos por receptores relativamente invariantes semelhantes ao complexo principal de histocompatibilidade, pertencentes à família CD1. Entre os componentes lipídicos da parede celular micobacteriana predomina o ácido micólico, importante fator de virulência que protege o bacilo contra exposição às drogas e contra o ambiente hostil do fagolisossoma, compartimento onde o bacilo permanece no macrófago. O artigo do grupo de Lalvani mostra neste trabalho publicado no JCI a participação de células T que reconhecem o ácido micólico via CD1 em respostas adaptativas, de memória, apresentando fenótipos tanto de células de memória central como de memória efetora [2].

Os autores identificaram e caracterizaram as células T CD1b+ específicas ao ácido micólico observadas em pacientes com tuberculose (TB) ativa em vários períodos antes ou após o tratamento e em pacientes com TB latente. A maioria dos pacientes com TB não tratada apresentou células T específicas ao ácido micólico. Estas células eram principalmente CD4+, embora células CD8+ e duplo-negativas também tenham sido observadas. O estímulo após depleção de células CD56+ e TCR gama-delta+ e a marcação intracelular da produção de IL-2 e IFN-gama mostrou que a resposta a ácidos micólicos é mediada por células TCR alfa-beta+. As células apresentavam predominância de fenótipo de células de memória efetora (produção simultânea de IFN-gama e IL-2 aliada a ausência de expressão de CD45RA e CCR7), porém também foram observadas células com fenótipo de células de memória central (ausência de expressão de CD45RA aliada a expressão de CCR7, produzindo ou IL-2 ou mesmo IFN-gama). Foi ainda possível expandir células produtoras de IFN-gama a partir do sangue periférico, ao colocar células mononucleares em contato com células dendríticas autólogas pulsadas com ácidos micólicos (ELISpot pós-cultivo), tanto em pacientes com TB antes do tratamento como até mais de um ano após o tratamento. A fenotipagem das células responsivas a ácidos micólicos ex vivo neste período mostrou uma população de células com fenótipo de células de memória efetora semelhante ao demonstrado como predominante antes do tratamento. Vale ressaltar que já no período de seis meses após o tratamento a frequência de células responsivas ex vivo tinha caído acentuadamente, sugerindo que a expansão de clones responsivos nestes períodos mais tardios pelo ensaio de ELISpot pós-cultivo deveu-se a uma resposta de memória.

Os autores sugerem que as células T específicas ao ácido micólico funcionam mais como parte do sistema imune adaptativo do que inato. Sendo altamente imunogênico e capaz de ativar produção de células T específicas, o ácido micólico pode ser um candidato importante como componente de vacinas de subunidades contra a tuberculose.


Referências:

[1] S. Meraviglia, S. El Daker, F. Dieli, F. Martini, A. Martino, γδ T Cells Cross-Link Innate and Adaptive Immunity in Mycobacterium tuberculosis Infection, Clin Dev Immunol. 2011 (2011).
[2] Montamat-Sicotte, D., Millington, K., Willcox, C., Hingley-Wilson, S., Hackforth, S., Innes, J., Kon, O., Lammas, D., Minnikin, D., Besra, G., Willcox, B., & Lalvani, A. (2011). A mycolic acid–specific CD1-restricted T cell population contributes to acute and memory immune responses in human tuberculosis infection Journal of Clinical Investigation DOI: 10.1172/JCI46216.

Erro de classificação, associação epidemiológica ... e Bayes!

Post de Mauricio Cardeal

Comentário ao artigo: Tarafder, M., Carabin, H., McGarvey, S., Joseph, L., Balolong, E., & Olveda, R. (2011). Assessing the Impact of Misclassification Error on an Epidemiological Association between Two Helminthic Infections PLoS Neglected Tropical Diseases, 5 (3) DOI: 10.1371/journal.pntd.0000995





Mais uma vez agradeço ao time do Blog Sciencia Totum Circumit Orbem pelo convite ao comentário.

O estudo objetivou demonstrar o impacto do ajuste para o erro na estimativa do efeito da infecção por geo-helmintos na incidência acumulada em 12 meses da infecção por S. japonicum devido ao erro de classificação. O erro de classificação refere-se ao método Kato-Katz.

Ou seja, de que modo o erro de classificação do método pode mudar uma medida de associação !

Os argumentos dos autores:

– A excreção de ovos de helmintos nas fezes humanas varia no tempo;
– Número desigual de amostras de fezes entre os indivíduos afeta a sensibilidade de testes diagnósticos de S. japonicum e geo-helmintos.
– A coleta de amostras de fezes em dias consecutivos aumenta a sensibilidade de testes coprológicos.

Comentário: sabemos que a prevalência afeta o valor preditivo positivo(1). Quanto maior a prevalência da doença, maior é a chance daquela doença em particular ser diagnosticada, uma vez que o teste diagnóstico seja positivo. Exemplo simples: quanto mais prevalente for a tuberculose em uma área, qualquer tosse pode ser sinal de tuberculose !

Mas o mesmo não ocorre com a sensibilidade, pois ela é uma característica do teste diagnóstico e sendo rara ou não a doença em particular, o teste, quanto mais sensível for, mais diagnosticará corretamente. Ou seja, a sensibilidade de um teste diagnóstico independe da prevalência. Por exemplo, se um teste for 100 % sensível, ele detectará corretamente um caso, se apenas um caso houver. Daí que é correto dizer que se temos mais amostras de fezes, maior é a chance de se fazer o diagnóstico, mas às custas do aumento do valor preditivo positivo e não da sensibilidade. A sensibilidade é a mesma com uma, duas ou três amostras. Ou o Kato-Katz detecta ou ele não detecta a cada amostra de fezes que a ele submeto. Se na primeira amostra se detecta o S.japonicum, pronto, o diagnóstico foi feito. Se, só se detecta quando obtemos a segunda amostra, pronto. E assim por diante.

Poderíamos então exagerar e obter 365 amostras de fezes, uma a cada dia para aumentar a capacidade de detecção do teste. Não, de forma alguma ! Não é a capacidade de detecção do teste que está aumentando e sim a chance do S.japonicum se apresentar ao longo do ano !!! Ao invés de uma, duas ou três, são 365 vezes !!! Mas o Kato-Katz continua o mesmo ! Como dizia mais ou menos a propaganda: A minha voz continua a mesma, mas os meus cabelos, quanta diferença !


Comentário: me parece que os autores fizeram uma confusão aqui entre sensibilidade e valor preditivo e isso compromete seriamente o artigo.


Fonte de dados
Os autores utilizaram dados de um outro estudo prospectivo efetuado nas Filipinas, ocorrido entre 2004 e 2005, que objetivava avaliar o efeito dos sistemas de gerenciamento de água e animais sobre a transmissão do S. japonicum.

Mensuração
A técnica de Kato-Katz foi empregada para detectar ovos dos helmintos. O número de ovos de S. japonicum por grama de fezes foram contados e os indivíduos foram classificados como infectados ou não infectados.

Tratamento
Os indivíduos foram tratados para as helmintíases no início do estudo e ao final de 12 meses de acompanhamento. Assumiu-se 100 % de eficácia do Praziquantel.

Comentário: um tratamento 100 % eficaz pode não ser 100 % efetivo ! Para os propósitos do estudo se deveria assumir 100 % de efetividade, mas isso é apenas um pequeno ajuste conceitual.

Unidade amostral: indivíduos e famílias. De 134 vilas endêmicas para S. japonicum em 2002, 50 atenderam os critérios de inclusão.
Os critérios de inclusão das vilas: segurança e acesso da equipe de pesquisa, localização e número de famílias em cada vila.
Foram sorteadas no máximo 35 famílias de cada vila e foram sorteados no máximo 6 indivíduos por família: amostragem por estagiamento em 2 níveis – uma amostragem probabilística.

Análise estatística
Optou-se pelo modelo de regressão logística hierárquica de classe latente a partir da concepção Bayesiana de probabilidade.

Comentário: nome complicado, não ?

Modelos hierárquicos de regressão são empregados com o objetivo de se considerar simultaneamente variabilidades em níveis hierárquicos diferentes, por exemplo: admitamos duas escolas consideradas muito diferentes quanto às estrutura física e pedagógica, uma muito boa, a outra muito ruim. Consideremos ainda duas crianças com idades semelhantes, uma muito inteligente, a outra pouco inteligente (não vamos complicar, é apenas um exemplo simples e didático). As crianças, portanto, variam, assim como variam as escolas. Agora, se colocarmos a criança muito inteligente na escola ruim e vice-versa, notaremos após algum tempo que as crianças modificarão seus respectivos desempenhos, por causa do efeito da escola. São então dois níveis hierárquicos distintos sendo avaliados conjuntamente. O nível 1 corresponde a variação entre crianças e o nível 2, corresponde à variação entre escolas.

A análise hierárquica (modelagem multinível)(2) no estudo seria justificada pelo plano amostral (estagiamento) e pela concepção adotada de unidade amostral, mas a diferença mesmo está no uso do conceito subjetivista de probabilidade.

Classes latentes são perfis construídos a partir de variáveis que não podem ser observadas diretamente, mas através da manifestação das variá¬veis observáveis. Quando digo que há um perfil de risco para eventos coronarianos, as variáveis observáveis, por exemplo, sedentarismo, hábito de fumar, estresse psicológico, etc, avaliadas conjuntamente em um modelo que me revelam indiretamente as classes latentes, tais como: ser sedentário, ser fumante, estar agudamente estressado ou todas as combinações possíveis. Esses perfis são as classes latentes.

No artigo os autores assumiram independência entre as medidas do Kato-Katz. Por não disporem de um padrão-ouro para a detecção das parasitoses, consideraram o “verdadeiro estado de infecção” dos sujeitos da pesquisa como dado latente. Ou seja, o “verdadeiro estado de infecção” de cada sujeito da pesquisa foi estimado uma vez que a sensibilidade e a especificidade eram conhecidas de estudo prévio (dos mesmos autores), graças ao algoritmo aleatorizador de Gibbs(1) que é um gerador pseudo aleatório de uma sequência de amostras da distribuição conjunta de probabilidades de duas ou mais variáveis aleatórias e que é capaz de produzir uma amostra da distribuição de interesse que é desconhecida. UFA !

Parece complicado, não é ? E de fato é !!!

No caso, seria: (n) número de amostras de fezes, (nd) número de detec¬ções corretas do S. japonicum e (pd) probabilidade de detecção dos ovos de S. japonicum (sensibilidade – distribuição a priori). Tanto n como pd variam para cada indivíduo pesquisado e cada um tem sua distribuição de probabilidade (em sendo variáveis aleatórias). A distribuição marginal resultante de nd gerada através da simulação de uma amostra aleatória bem grande (a partir dos dados) com uma “ajudinha” do Teorema do Limite Central pode-se estimar o número de detecções corretas do S. japonicum com aproximação. Que saída, hein ?

Para os seguidores de Bayes (subjetivistas), essa é uma solução adequada, mas os frequentistas não concordam. Quero lembrar que a maioria dos cursos de graduação e pós-graduação do Brasil ensinam estatística inferencial baseada na escola frequentista de probabilidade. Ou seja, aquilo que você provavelmente aprendeu sobre testes de hipótese, intervalos de confiança, usa os conceitos e formulações frequentistas. Os subjetivistas ainda não são tão populares. Afirmo que são escolas até então incompatíveis e que produzem probabilidades diferentes para um mesmo problema de investigação porque os conceitos e os métodos de análise são diferentes. Qual está certa ? Cada uma possui argumentos para dizer-se a mais correta. Portanto, ao desejar fazer uma análise estatística inferencial, deve-se primeiramente escolher a escola e só em seguida definir o plano de análise.

Uma observação: nem todos os pacotes estatísticos fazem estatística Bayesiana. O que você possui, faz ? O pacote estatístico livre R(3), faz !

Um alerta: corremos o risco de apresentar uma solução para o problema errado (erro tipo 3) ou uma solução ruim para o problema certo. Assim, cuidado com o uso da estatística sem fundamentação teórica adequada; cuidado com a “mordida do rato” no seu pacote estatístico preferido: clique, clique, clique.


Voltando ao artigo: foram considerados sob risco aqueles indivíduos que forneceram pelo menos uma amostra de fezes, aceitaram participar do estudo no “baseline” e receberam tratamento.

Dos resultados apresentados, vou destacar apenas as associações entre ancilostomíase e S. japonicum, para ilustrar os comentários que farei em seguida.

Para a infecção pelo ancilóstoma sem considerar qualquer erro de classificação (erro de classificação tanto para ancilóstoma como para S. japonicum), a odds-ratio (OR) da associação com S. japonicum foi igual a 1,28.

Para a infecção pelo ancilóstoma considerando apenas o erro de classificação para ancilóstoma, a OR da associação com S. japonicum foi igual a 1,48.

Para a infecção pelo ancilóstoma considerando apenas o erro de classificação para S. japonicum, a OR da associação com S. japonicum foi igual a 1,55.

Para a infecção pelo ancilóstoma considerando ambos os erros de classificação, a OR da associação com S. japonicum foi igual a 2,13.

Os autores concluíram que a ancilostomíase esteve associada com o aumento da incidência acumulativa de S. japonicum em 12 meses e que estudos que não ajustam para o erro de classificação não teriam a capacidade de detectá-la adequadamente.

Comentários:

Será que houve erro de classificação ? Segundo os autores, sim. Entendo que sim, simplesmente porque o Kato-Katz não é 100 % sensível e 100 % específico, mas de quanto seria esse erro ? Para calcular adequadamente o grau do erro precisaria examinar as amostras de fezes através de um método padrão-ouro. Acontece que no presente estudo não há padrão-ouro de fato e sim uma simulação probabilística através do algoritmo aleatorizador de Gibbs para afirmar sobre o “verdadeiro estado de infecção” dos sujeitos da pesquisa. Ora, isso é tipicamente do escopo do raciocínio probabilístico, o qual não produz certeza. Se é então provável, não é certo. Eu não teria essa coragem de assumir como padrão-ouro o resultado dessas “manobras” e por isso não considero possível a obtenção do grau do erro de classificação. No máximo posso “aceitar” como um “provável” erro de classificação. Esse “aceitar”, apesar da fundamentação teórica oferecida pela Teoria Subjetivista de Probabilidade, continua sendo probabilidade e portanto, é uma questão de aposta, sorte, azar e uma boa dose de crença. Então, será mesmo que as odds-ratios calculadas estão medindo mesmo o erro de classificação ? Prefiro ser mais prudente. Afinal, a solução dos autores está melhorando a mensuração da associação ou a está a enviesando ainda mais, através de um viés de subjetividade ? Entretanto, se você está convencido dos argumentos da Escola Bayesiana, não há qualquer problema, a não ser tomar os devidos cuidados (que são muitos) na utilização das suas técnicas analíticas.


Se os argumentos anteriores operam fortemente em torno da noção de crença e credibilidade, por outro lado, os autores cometeram um erro ao afirmar e assumir que a coleta de amostras de fezes em dias consecutivos aumenta a sensibilidade de testes coprológicos e isso elimina completamente a possibilidade de uma medida correta do erro de classificação.

Esse artigo é um bom exemplo da criatividade humana, essencial para a vida e para a ciência. Ele é rico em método e coerente com uma proposta inferencial da Escola Bayesiana de Probabilidade. Bayesianos, mãos à obra !




Referências:

1. Massad E, Menezes RX de, SILVEIRA PS, Ortega NRS. Métodos quantitativos em medicina. Manole; 2004.
2. Goldstein H. Multilevel Statistical Models. 4th ed. Wiley; 2010.
3. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing [Internet]. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing; 2011. Available from: http://www.R-project.org

TRAIL regula a apoptose neutrofílica e aumenta a resolução da inflamação

Post de Sarah Falcão (LIP-CPqGM/FIOCRUZ)

A resolução da inflamação aguda requer que neutrófilos (PMNs) recrutados sejam submetidos à morte celular programada por apoptose. Entretanto, a vida dos PMNs pode ser prolongada nos tecidos, devido ao atraso da apoptose nos sítios de inflamação pelos estímulos pro-inflamatórios. Além dos receptores de morte FasL e TNF-a, responsáveis por induzir apoptose, há o TRAIL que induz apoptose para eliminar PMNs senescentes e circulantes, sem que haja ativação de NF-kB in vitro ou os efeitos quimioatraentes do FasL. TRAIL é uma proteína de membrana tipo II, expressa principalmente em leucócitos. Em humanos, TRAIL interage com 4 receptores de membrana, TRAIL-R1 e R2 que ativam caspase e NF-kB, enquanto que TRAIL-R3 e R4 têm domínios de morte truncado e não ativam caspases, mas podem ativar NF-kB.

Este trabalho visou determinar o potencial da sinalização via TRAIL em modular a apoptose neutrofílica, durante uma inflamação caracterizada pela presença maciça de PMNs. Com este intuito, foram utilizados dois modelos: dano agudo pulmonar mediado pelo LPS e peritonite induzida por zymozan. Inicialmente, PMNs obtidos de sangue periférico de animais B6 WT e TRAIL deficientes, receberam doses de TRAIL exógeno e foi visto, in vitro, por microscopia, um aumento da porcentagem de apoptose após 6 e 18hs de incubação em ambas linhagens. Após a indução de inflamação pela infiltração de LPS e, posterior lavagem bronco-alveolar, foi mostrado um aumento do número células totais após 48hs no animal TRAIL deficiente, assim como, o número total e a porcentagem de PMN. Entretanto, a porcentagem de apoptose foi significantemente maior nos animais WT e o mesmo foi observado quanto à expressão de Anexina V. A apoptose foi também quantificada usando marcação TUNEL e, mais uma vez, a apoptose foi menor nos animais TRAIL deficientes.

No modelo de peritonite, induzida pelo zymozan, foi identificada uma significante diminuição da porcentagem de PMNs apoptóticos após 24 e 48hs no animal TRAIL deficiente. Em experimentos in vivo, 6hs após o tratamento com zymozan, foi injetado TRAIL exógeno e, após 24hs, o número de PMNs e contagens da apoptose foram acessados. O tratamento com TRAIL, levou à diminuição do número de PMNs e porcentagens de células apoptóticas em animais TRAIL deficientes e WT. Esses dados demonstram que TRAIL é responsável pela indução de apoptose dos PMNs, contribuindo para a resolução da inflamação e, além disso, sugere que TRAIL pode ser utilizado no tratamento da inflamação pulmonar e sistêmica.

McGrath EE, Marriott HM, Lawrie A, Francis SE, Sabroe I, Renshaw SA, Dockrell DH, & Whyte MK (2011). TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) regulates inflammatory neutrophil apoptosis and enhances resolution of inflammation. Journal of leukocyte biology PMID: 21562052

As células T CD4 possuem papel importante na diferenciação de células dendríticas inflamatórias a partir de monócitos

Post de Natália Machado




As células dendríticas (DCs) são fundamentais para a geração de resposta imune e são compostas por muitos subtipos. Em homeostasia, são as convencionais residentes e migratórias, as plasmocitóides e as de Langerhans. Após estimulo inflamatório, monócitos são recrutados e diferenciam em DC de modo dependente de GM-CSF. Embora muitas células linfóides e mielóides produzam GM-CSF in vitro, ainda não está claro qual a fonte desta citocina in vivo. O trabalho de Campbell e colaboradores [1] mostra de forma elegante a participação de células T CD4 na diferenciação das células dendríticas inflamatórias no modelo experimental de artrite.

Os autores estavam estudando o mecanismo de proteção contra a artrite em camundongos deficientes em NF-κB1 (Nfkb1-/-), mas não em c-Rel1 (Rel-/-), que em trabalho anterior eles demonstraram ser dependente de células T CD4 [2]. Eles transferiram células T CD4 esplênicas de camundongos WT, Il1r-1-/- ou Nfkb1-/- para Rag1-/-, e verificaram que nos camundongos que receberam células Nfkb1-/- não houve indução de artrite, diferentemente daqueles que receberam células T CD4 WT ou Il1r-1-/-. Apesar de que nos animais Nfkb1-/- a morte de células T CD4 por apoptose é maior do que a observada nos animais WT (uma vez que Rel/NF-κB é importante para sobrevivência celular por inibir apoptose) os autores demonstraram que em camundongos Nfkb1-/- transgênicos para Bcl2 em todos os leucócitos houve redução na apoptose de células T CD4 in vitro, porém manteve-se a inibição da artrite. Isto sugere que a sobrevivência das células T CD4 não é o mecanismo de proteção nos animais Nfkb1-/-.

Ao avaliar os efeitos da deficiência em NF-κB1 na expressão de marcadores de ativação, receptores e produção de citocinas, os autores verificaram expressão normal de CD25, CD69 e IL-17, porém aumentada de IL-2 e diminuída de GM-CSF, coincidente com menores níveis desta citocina no sobrenadante das culturas de células T CD4 estimuladas. Confirmando a importância deste último achado para o desenvolvimento da doença, a transferência de células T CD4 de animais GM-CSF-/- para Rag-/- levou a redução significativa da artrite, e a injeção de GM-CSF restaurou completamente a resposta dos animais Nfkb1-/- em todos os aspectos da doença. In vivo, no tecido sinovial inflamado e no linfonodo poplíteo drenante de animais WT, uma elevada proporção da população de células CD11c+ era constituída por dendríticas derivadas de monócitos, mas sua quantidade estava reduzida no linfonodo de animais GM-CSF-/-.






Animais depletados para CD11c(hi) foram utilizados para estabelecer a importância das DCs neste modelo. A doença foi significativamente reduzida nestes camundongos, mas alguma artrite residual estava presente. Para avaliar o papel do NF-κB, DCs de animais Nfkb1-/- foram utilizadas in vitro para MLR alogênico OVA-específico. Os resultados obtidos mostram que DCs Nfkb1-/- são similares às WT. No entanto, quando animais OT-II foram cruzados com animais Nfkb1-/-, OVA-específicos, as células T CD4 Nfkb1-/- não responderam ao estímulo in vitro com DCs esplênicas carregadas com OVA. Os autores também demonstraram a importância dos mesmos achados em outro modelo experimental, de indução de peritonite.

Os autores, com base nos achados mais relevantes deste estudo, concluem que NF-κB1 tem papel fundamental na produção de GM-CSF por células T CD4 ativadas durante resposta inflamatória. Além disso, GM-CSF produzido por estas células induz o desenvolvimento preferencial de DCs derivadas de monócitos.


Referências:

[1] Campbell IK, van Nieuwenhuijze A, Segura E, O'Donnell K, Coghill E, Hommel M, Gerondakis S, Villadangos JA, & Wicks IP (2011). Differentiation of Inflammatory Dendritic Cells Is Mediated by NF-{kappa}B1-Dependent GM-CSF Production in CD4 T Cells. J Immunol

[2] I.K. Campbell, S. Gerondakis, K. O’Donnell, I.P. Wicks, Distinct roles for the NF-kappaB1 (p50) and c-Rel transcription factors in inflammatory arthritis, J. Clin. Invest. 105 (2000) 1799-1806.

CELL BIOLOGY OF PATHOGENS

Quantiferon para a Leishmaniose Visceral

Post de Marcia Weber Carneiro (LIP/CPqGM-FIOCRUZ)

Interferon-Gamma Release Assay (Modified QuantiFERON) as a Potential Marker of Infection for Leishmania donovani, a Proof of Concept Study Kamlesh Gidwani

Métodos sorológicos como ELISA ou teste cutâneo de leishmanina (LST) vêm sendo utilizados para documentar a infecção, porém seus valores como marcadores de infecção ainda não foram bem estabelecidos. Estes testes detectam uma infecção mais inicial, mas o tempo que ambos se mantêm positivos e se a resposta a ambos difere entre pacientes com calazar ou indivíduos infectados assintomáticos, ainda não estão claros. O LST é um marcador de imunidade mediada por células, e permanece positivo por muitos anos após infecção inicial. Não obstante, marcadores de resposta imune celular são promissores; a proliferação de células T pode ser resultado da ativação destas células e medir a liberação de IFN pelas mesmas refina a avaliação da resposta imune celular.

Um ensaio in vitro de liberação de IFNgama (Quantiferon- TB Gold) foi desenvolvido para documentar a infecção latente por Mycobacteria. Este método detecta IFNgama em sangue total com boa sensibilidade e especificidade. Assim, um ensaio similar poderia ser desenvolvido para a leishmaniose. Jones e colaboradores, partindo desta premissa, desenvolveram um teste baseado no sistema QuantiFERON e avaliaram seu potencial em detectar a infecção por L. donovani, agente da leishmaniose visceral. Primeiramente, eles buscaram identificar um antígeno com alta especificidade e que estimule liberação máxima de IFNgama, no sangue total de pacientes com LV, 6 meses após a cura. Dentre os antígenos testados, o SLA obteve 100% de especificidade, pois nenhum voluntário saudável de área não endêmica foi IFNgama positivo. Os antígenos H2B e H2B + PSA-2 também geraram boa especificidade (100% e 91%), porém com menor sensibilidade comparada ao SLA. Um resultado interessante no trabalho foi que pacientes sintomáticos com LV apresentaram alta produção de IFNgama em resposta aos antígenos, principalmente com SLA. Outros trabalhos já demonstraram que estes indivíduos estão imuno-suprimidos e que suas células mononucleares não proliferam nem produzem IFNgama após estimulo com antígeno.

Os autores concluem que um marcador de infecção é essencial para estudos de intervenção em vacinas ou para o controle de vetores e para o monitoramente da transmissão em áreas endêmicas. Eles apontam que o estudo foi realizado com um n pequeno, sendo necessária a validação do teste em uma amostra maior. O ensaio é muito prático e simples de conduzir em laboratório e pode ser um potencial marcador em pesquisas epidemiológicas se sua validação for realmente confirmada.

Gidwani, K., Jones, S., Kumar, R., Boelaert, M., & Sundar, S. (2011). Interferon-Gamma Release Assay (Modified QuantiFERON) as a Potential Marker of Infection for Leishmania donovani, a Proof of Concept Study PLoS Neglected Tropical Diseases, 5 (4) DOI: 10.1371/journal.pntd.0001042

O início imediato da terapia antirretroviral pode evitar a transmissão do HIV aos parceiros soronegativos de pacientes infectados

post de Theolis Bessa

Foi publicada no Medscape a divulgação dos resultados iniciais de um ensaio clínico multicêntrico conduzido em 13 sítios, incluindo o Brasil, que apontam para 96% de redução na transmissão do vírus do parceiro infectado para o não-infectado, quando o parceiro infectado iniciou a terapia anti-retroviral (ART) antes que se atingisse o limiar de 250 células CD4+/mm3. Também houve redução do número de casos de tuberculose extrapulmonar entre os que iniciaram a terapia imediatamente. Os resultados mostraram-se tão promissores que o grupo controle foi descontinuado, sendo-lhes oferecida a terapia imediatamente. O estudo, financiado pelo NIAID, é coordenado pelo Dr. Myron Cohen, M.D., diretor do Institute for Global Health and Infectious Diseases da University of North Carolina, e pode ser acompanhado na página oficial do NIAID.

Mycobacterium tuberculosis induz um modo atípico de morte celular para escapar de macrófagos infectados

Post de Thaís Peleteiro

A morte celular de macrófagos após a infecção pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb)desempenha um papel central na patogênese da tuberculose. Certas cepas atenuadas induzem apoptose de macrófagos infectados, no entanto cepas virulentas de Mtb suprimem esta resposta do hospedeiro.

Neste artigo publicado no final de março na revista Plos One, os autores discutem sobre as características da morte celular em macrófagos provenientes da medula óssea de camundongos C57/BL6 infectados com Mtb virulento (H37Rv) em alta taxa de infecção (MOI) [1]. Os autores já haviam apresentado que o Mtb virulento induz morte celular quando a carga bacilar excede aproximadamente 20 Mtb por macrófagos [2], mas a natureza exata dessa forma de morte ainda não está bem definida.

Os autores demonstram que a morte celular induzida pelo Mtb virulento envolve a permeabilização da membrana mitocondrial, com liberação de citocromo c e perda do potencial transmembrana, independente da regulação por Bax ou Bak, que atuam na via intrínseca da apoptose. Ocorre permeabilização da membrana lisossômica seguida pela destruição da bicamada lipídica e concomitante degradação de várias espécies de fosfolipídios presentes, havendo envolvimento de lipases lisossômicas. Diferente de muitos outros exemplos de morte celular lisossômica, a que é causada pelo Mtb independe de catepsinas B, L ou D. Também ocorreu na ausência da caspase-1 e de catepsina-B ativada, sendo assim, diferente da piroptose ou pironecrose, que constituem em formas de morte celular induzidas por outros patógenos a exemplo da Shigella, Salmonella, Fransciella ou Legionella.

Os autores implicaram a participação do sistema de sinal regulatório de dois componentes (PhoPR) do Mtb, na indução da permeabilização da membrana lisossômica, utilizando uma linhagem mutante (RvΔphoPR) incapaz de bloquear a fusão lisossômica [3]. A cepa mutante RvΔphoPR falhou em induzir a permeabilização da membrana lisossômica e em induzir lesão mitocondrial, e sua capacidade de induzir a morte de macrófagos foi significativamente atenuada.



A lesão mitocondrial (representada pela dissipação do potencial transmembrana) foi mensurada em macrófagos desafiados com a cepa H37Rv e comparados com macrófagos infectados com Mtb mutantes, que não apresentavam o gene espA (ΔRD1ΔespA; gráfico da esquerda) ou Mtb mutantes que não apresentavam o sistema de sinal regulatório de componentes PhoPR (ΔphoPR; gráfico do centro). No gráfico da direita, a morte celular, avaliada pela incorporação do iodeto de propídio (PI), foi verificada em macrófagos não infectados e macrófagos desafiados com a cepa H37Rv, RvΔRD1ΔespA ou RvΔphoPR (18h). A cepa mutante ΔphoPR foi incapaz de induzir a morte celular de macrófagos.


Os autores associam ao Mtb um novo mecanismo de morte celular mediado por lípases lisossômicas, e indicam que os genes micobacterianos codificantes do sistema de sinal regulatório de dois componentes PhoPR desempenham um papel importante, atuando na citotoxicidade e mecanismo de morte celular. Vale ressaltar que as características estruturais das células infectadas mostram condensação periférica da cromatina nuclear e protusão das membranas nucleares a partir das áreas da condensação da cromatina após 3h (associadas com apoptose, porém não foi verificada a condensação progressiva da cromatina nuclear nem a fragmentação do núcleo). Na fase tardia ou 18h após a infecção, observou-se exposição do citoesqueleto e de organelas intracelulares, rupturas na membrana plasmática, que definem a necrose, porém, sem aumento do volume celular. Essas características aproximam este tipo de morte da necroptose [4,5], embora os autores tenham demonstrado que a morte celular induzida pelo Mtb é independente de TNF [2].


Referências:
[1] Lee, J., Repasy, T., Papavinasasundaram, K., Sassetti, C., & Kornfeld, H. (2011). Mycobacterium tuberculosis Induces an Atypical Cell Death Mode to Escape from Infected Macrophages PLoS ONE, 6 (3) DOI: 10.1371/journal.pone.0018367
[2] J. Lee, H.G. Remold, M.H. Ieong, H. Kornfeld, Macrophage apoptosis in response to high intracellular burden of Mycobacterium tuberculosis is mediated by a novel caspase-independent pathway, J. Immunol. 176 (2006) 4267-4274.
[3] N.L. Ferrer, A.B. Gomez, O. Neyrolles, B. Gicquel, C. Martin, Interactions of Attenuated Mycobacterium tuberculosis phoP Mutant with Human Macrophages, PLoS ONE. 5 (2010) e12978.
[4] P. Vandenabeele, L. Galluzzi, T. Vanden Berghe, G. Kroemer, Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (2010) 700-714.
[5] L. Galluzzi, G. Kroemer, Necroptosis: A Specialized Pathway of Programmed Necrosis, Cell. 135 (2008) 1161-1163.

Transmissão transplacentária de Leishmania infantum

Post de Rômulo Santiago (LIP/CPqGM-FIOCRUZ)

A leishmaniose visceral zoonótica (ZVL) é um sério problema de saúde pública nos Estados Unidos, uma vez que: i) os cães são os reservatórios domésticos preferíveis para flebotomíneos, que transmitem a infecção por L. infantum a humanos, e ii) que a prevalência anual de animais PCR positivo para Leishmania tem crescido. A contenção desta doença está associada à eutanásia dos animais infectados e ao controle do vetor. Contudo, o meio de transmissão de L. infantum em cães da América do Norte, fora de regiões endêmicas, não era totalmente conhecido, sendo possível ocorrer via vertical/transplacentária e horizontal/venérea. Assim, para avaliar a possibilidade de transmissão placentrária e seu efeito sobre a resposta imune contra Leishmania, os autores deste estudo utilizaram-se de uma cadela grávida e infectada por L. infantum doada à Universidade Estadual de Iowa. Dos doze filhotes nascidos oito foram eutanasiados no pós-parto recente (24hs) e quatro após três meses, sendo avaliados quanto à presença de Leishmania através de PCR quantitativo para cinetoplasto de L. infantum (kqPCR) e histopatologia e a resposta imune através ensaio de proliferação celular. Dez dos doze filhotes apresentaram kqPCR positivo em vários tecidos indicando infecção disseminada, apesar de não apresentarem lesão macroscópica ou histológica. Além disso, todos apresentaram resposta imune proliferativa de célula T CD4+ específica para L. infantum. Deste modo, esta forma de transmissão poderia sustentar a infecção nesta população, colocando-se como um novo desafio para o controle da ZVL.

Boggiatto, P., Gibson-Corley, K., Metz, K., Gallup, J., Hostetter, J., Mullin, K., & Petersen, C. (2011). Transplacental Transmission of Leishmania infantum as a Means for Continued Disease Incidence in North America PLoS Neglected Tropical Diseases, 5 (4) DOI: 10.1371/journal.pntd.0001019

Hemoglobina falcêmica confere tolerância à infecção pelo plasmódio

Post de Vitor R R de Mendonça



Recentemente foi publicado por Ferreira et al(1) na Cell um trabalho correlacionando a hemoglobina da doença falciforme com a proteção à forma cerebral da malária em camundongos infectados pelo Plasmodium berghei. Que a doença falciforme e outras hemoglobinopatias - talassemias, HbC, HbE, etc - conferem resistência à forma sintomática da malária não é mais novidade. Contudo, a grande relevância deste artigo é descrever o provável mecanismo em que a hemoglobina falcêmica (HbS) garante tolerância ao plasmódio. E artigo vindo do grupo do Miguel Soares não seria de espanto se esperar o envolvimento da heme oxigenase-1 (HO-1) neste processo. A HO-1 é uma isoforma indutível da heme-oxigenase e é responsável em catabolizar o heme livre em biliverdina, ferro e monóxido de carbono (CO).

Descrevo alguns dos resultados mais importantes do manuscrito:

A HbS induz a expressão aumentada da HO-1 em células hematopoiéticas através do mecanismo envolvendo o fator de transcrição Nrf2. Além disso, o subproduto CO previne o acúmulo de heme livre depois da infecção pelo parasita, suprimindo desta forma a patogênese da malária cerebral. Outro resultado interessante é que a HbS inibe a ativação e/ou expressão de células T C8+ que reconhecem antígenos expressos no plasmódio.

Vale ressaltar, que todos esses mecanismos que levam a um efeito protetor da HbS independem da carga parasitária, sugerindo que essa hemoglobinopatia confere tolerância do hospedeiro ao parasita.

Posso adjetivar este trabalho como inovador e intrigante. Inovador, porque é o primeiro a descrever uma via, bem fundamentada, em que a HbS confere tolerância à malária. Intrigante, na medida em que propicia questionamentos relativos ao papel de outras moléculas e vias associadas ao HO-1 nesse contexto - hemopexina, metabolismo do ferro, CD163, etc. Destaco também a possibilidade de intervenção terapêutica que o estudo propõe na via Nrf2/HO-1 para o tratamento da malária grave.

Referência:

(1) Ferreira, A., Marguti, I., Bechmann, I., Jeney, V., Chora, �., Palha, N., Rebelo, S., Henri, A., Beuzard, Y., & Soares, M. (2011). Sickle Hemoglobin Confers Tolerance to Plasmodium Infection Cell, 145 (3), 398-409 DOI: 10.1016/j.cell.2011.03.049

É sobre Hamlet, mas não sobre Shakespeare

Post de Kiyoshi Fukutani (LIP-CPqGM/FIOCRUZ)

Durante os estudos da atividade microbicida do leite humano, foram identificados dois complexos: o alfa lactalbumina (ALA) e um ácido oleoso, os quais são capazes de induzir apoptose em células tumorais, sem interferir no ciclo de vida das células normais. Este mesmo complexo é chamado HAMLET (Human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells) e apresentou uma grande atividade bactericida contra patógenos específicos da cavidade oral e do trato respiratório, principalmente contra o Streptococcus pneumoniae, pois estes apresentam a alfa-lactalbumina na forma insaturada no carbono 18. A forma nativa da ALA não apresenta uma atividade bactericida ou antitumoral.
A morte celular programa ou apoptose é um fenômeno conhecido em células eucariotas, caracterizada por alterações nucleares e de membrana como: a perda de membrana, a condensação da cromatina e a fragmentação do DNA, sendo um mecanismo importante para regulação e manutenção da homeostase em organismo multicelulares. Em organismos procariotos como as bactérias este mecanismo não é bem explicado e uma espécie de morte celular programada primitiva é descrita no trabalho de Anders e colaboradores, que tenta demonstrar que existe apoptose em S.pneumoniae ao entrar em contato com HAMLET.
Os primeiros experimentos demonstram a atividade antitumoral e bactericida do complexo HAMLET, utilizando S.pneumoniae e uma linhagem de célula neoplásica leucêmica (Jurkat), em uma curva dose resposta. Os autores antes de caracterizar morfologicamente a “apoptose” em procariotos tiveram a preocupação de realizar o ensaio em outra linhagem de células proveniente de um carcinoma tratado com HAMLET, e demonstraram a existência de alterações na condensação da cromatina e fragmentação do DNA. Tentando compreender como ocorre esta fragmentação tanto no carcinoma como no S.pneumoniae, foram feitos experimentos com DNAse e seus cofatores (cálcio e Magnésio), mostrando que o mecanismo ainda não é compreendido e independe de DNAse.
Tentando analisar as alterações da morte celular os autores resolvem investigar o dano mitocondrial e descobrem que o HAMLET interfere na membrana plasmática da mitocôndria despolarizando-a (sendo dependente de cálcio). Experimentos com o Inibidor das caspases (zVAD) não alteram a fragmentação do DNA, sendo um evento independente de caspase, porém dependente de certas proteases inibidas pela Calpeptina e Aprotinina. Os autores fecham os experimentos do paper testando o HAMLET com outras bactérias do trato respiratório como a Haemophilus influenzae, obtendo resultados próximos. No caso da E.coli que não é proveniente do trato respiratório, o HAMLET não conseguiu inibir o seu crescimento.
Na sua discussão os autores abordam as características bioquímicas do HAMLET, sendo ela talvez mais uma molecular importante no desenvolvimento do sistema imune da criança, ajudando no desenvolvimento da sua imunidade de mucosa.

Hakansson, A., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A., & Svanborg, C. (2011). Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex PLoS ONE, 6 (3) DOI: 10.1371/journal.pone.0017717

Nanopartículas e Leishmaniose

Post de Diego Moura Santos (LIP-CPqGM/FIOCRUZ)

Há quase 15 anos, Rafati e colaboradores descreveram uma fração de proteínas do SLA da forma amastigota de Leishmania, chamada de Cisteína Proteases (CPs) [1]. O grupo também mostrou que as CPs são capazes de induzir a produção de IFN-g em PBMC de humanos curados de leishmaniose cutânea [1]. Desde então, vários trabalhos foram publicados relatando a capacidade protetora destes antígenos contra diversas formas de leishmaniose.
Um dos trabalhos mais recentes analisa o potencial protetor das CPs do tipo I, II e III, encapsuladas em nanopartículas lipídicas sólidas (CPs-SLN)[2]. As nanopartículas lipídicas sólidas possuem características importantes, tais como proteção do DNA contra degradação por DNAses e lisossomos e a melhora da transfecção, pois facilitam a entrada da partícula nas células, devido a presença do colesterol. Além disso, são seguras, fáceis de armazenar e de serem produzidas em larga escala.
Com o objetivo de avaliar a capacidade protetora dos antígenos CPs nesta nova estratégia de “delivery”, camundongos BALB/c foram imunizados três vezes na pata e depois infectados com L. major GFP. Os animais imunizados com CPs-SLN apresentaram um menor tamanho de lesão comparado com o grupo que recebeu somente as CPs, mostrando que o encapsulamento dos antígenos melhorou o grau de proteção. Em relação à carga parasitária a redução foi de 86,3% no grupo que recebeu CPs-SLN, enquanto que nos animais imunizados somente com CPs a redução foi um pouco menor, 54,36%. Utilizando um sistema que capta fluorescência e fornece uma imagem precisa da extensão da infecção, os autores observaram que os animais imunizados com CPs-SLN apresentavam parasitas somente no local da inoculação, enquanto que nos grupos controles estes estavam espalhados por toda a área da pata. A explicação para uma melhora significativa no grau de proteção quando se utiliza a SLN como “delivery system” está na maior indução de uma resposta do tipo Th1, pois os camundongos imunizados com CPs-SLN apresentaram uma maior razão IFN-g/IL-5, comparados com o grupo CPs – 127,94 e 73,63 respectivamente.
Como conclusão, e extrapolando os dados do trabalho abordado acima, a ausência de novos adjuvantes que induzam um padrão de resposta Th1 e que sejam liberados para uso em humanos dificulta o trabalho dos vacinólogos, pois até o momento o único adjuvante liberado para uso em humanos é o Hidróxido de alumínio, que induz resposta do tipo Th2. Elaboradas de materiais biodegradáveis e seguras para aplicações em humanos, as partículas feitas de lipídeos, carboidratos e açúcares vêm ganhando espaço não somente no campo de vacinas, pelas suas características de adjuvantes, mas também no de tratamentos. No último caso, em função do alto custo para desenvolvimento de novas drogas, as empresas farmacêuticas estão empregando “delivery system” para melhorar a eficácia das drogas já existentes, como discutido em posts anteriores.

1. Rafati S, Couty-Jouve S, Alimohammadian MH, Louis JA (1997) Biochemical analysis and immunogenicity of Leishmania major amastigote fractions in cutaneous leishmaniasis. Clin Exp Immunol 110: 203-211.

2. Doroud D, Zahedifard F, Vatanara A, Najafabadi AR, Taslimi Y, Vahabpour R, Torkashvand F, Vaziri B, & Rafati S (2011). Delivery of a cocktail DNA vaccine encoding cysteine proteinases type I, II and III with solid lipid nanoparticles potentiate protective immunity against Leishmania major infection. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society PMID: 21530597

Saúde dos brasileiros é tema de especial do The Lancet

Fonte: Informe ENSP

Pela primeira vez, a revista inglesa The Lancet, uma das mais influentes publicações médicas do mundo, lançará um volume especial sobre a saúde dos brasileiros. Composto de seis artigos, este número reúne 29 especialistas em saúde pública de diversas instituições acadêmicas e de pesquisa do Brasil, Estados Unidos e Inglaterra. A pesquisadora da ENSP Maria do Carmo Leal, responsável pelo artigo sobre saúde materno infantil, revela expressiva queda na mortalidade infantil, tendo atingido a taxa de 20 óbitos por 1.000 nascidos vivos no ano de 2008. Além de Maria do Carmo, outros oito pesquisadores da Escola fazem parte dos autores responsáveis nesta edição. O lançamento deste número especial acontecerá no auditório da Opas/OMS, em Brasília (DF), nos dias 9 e 10 de maio, com a participação do ministro da Saúde, Alexandre Padilha.

Os artigos fazem uma ampla revisão sobre saúde e assistência médica da população brasileira, baseada em documentos e em análises originais de dados epidemiológicos. Os estudos ainda descrevem a história da assistência médica no Brasil, com ênfase na implantação do Sistema Único de Saúde, assim como a evolução recente das principais doenças e fatores de risco que afligem o Brasil. Os temas são: Sistema de saúde brasileiro, saúde materno infantil, doenças infecciosas, doenças crônicas, violência e lesões no Brasil, condições de saúde e inovações nas políticas públicas de saúde.

A cerimônia de lançamento da série especial da The Lancet contará com a presença do ministro da Saúde, Alexandre Padilha, de representantes da Opas/OMS, editores da revista The Lancet e dos autores dos artigos - de instituições como Fiocruz, USP, e das universidades Federais do Rio de Janeiro, do Rio grande do Sul, Pernambuco, Bahia, Minas Gerais, entre outras.

A programação conta ainda com a realização de mesas-redondas, momento em que os autores dos artigos farão uma apresentação sobre os seguintes estudos: O sistema de saúde brasileiro: história, avanços e desafios; Saúde de mães e crianças no Brasil: progressos e desafios; Sucessos e fracassos no controle de doenças infecciosas no Brasil: o contexto social e ambiental, políticas, intervenções e necessidades de pesquisas; Doenças crônicas não transmissíveis no Brasil: carga e desafios atuais; Violência e lesões no Brasil: efeitos, avanços alcançados e desafios futuros; e Condições de saúde e inovações nas políticas de saúde no Brasil: o caminho a percorrer. O evento é aberto ao público e não haverá inscrição. A abertura, no dia 9, será às 14 horas.

Immune attack!

Post de Theolis Bessa



PROCURA-SE gamers interessados em testar a nova versão deste jogo elaborado pela Federação dos Cientistas Americanos (FAS, Federation of American Scientists) desenhado para ajudar no ensino da imunologia para jovens. O projeto recebe financiamento do National Institutes of Health, e o jogo pode ser baixado gratuitamente por inscrição no site. Infelizmente ainda não funciona no Mac.

Divirtam-se!


Vejam a mensagem dos idealizadores do jogo:


Evaluate Immune Attack 2011. We need YOU!

To participate, please Register below. The evaluation requires three 40-minute periods in a computer lab. You will need students and parents to sign consent forms. Your students will play Immune Attack or a control game once in week one and once in week two. Then your students will take an online survey in week two. Immune Attack works on any PC, with any versions of Windows (XP, Vista, and 7). Immune Attack does not work on the Macintosh operating system.

Our data shows that students are learning the basic principles of cell biology and immunology. We need to increase our numbers to answer some important questions, such as, so non-gamer also learn from Immune Attack, or are they put off by the need to learn to fly a microbot. (So far they are not.) Students like playing Immune Attack because it feels like a real video game, involves flying and shows real details of cells and proteins inside the body.

We need some younger students, 5th-6th grades as well. (We still want 7-12th graders, too!) We have found that 7th grade students are learning similarly to 12th graders. We know that 5th and 6th grade students enjoy playing Immune Attack, so we want to know whether the game teaches them anything. Please help out!

Questions?

Email Melanie Stegman mstegman (at) FAS.org

THANK YOU!

Polimorfismos no gene para a IL-28B influenciam no sucesso do transplante de fígado em pacientes com HCV

post de Theolis Bessa

Foi noticiado esta semana pela Reuters health e Medscape News a comunicação, durante o Congresso Americano de Transplantes, de que um polimorfismo de base única (single nucleotide polymorphism, SNP) foi associado a melhor sobrevivência do transplante e maior período até a recorrência da doença em pacientes com o vírus C da hepatite. Apesar de que a recorrência acontece em todos os pacientes, aqueles que apresentam o alelo protetor passam em média 10 meses a mais sem doença.

A descoberta pode trazer implicações para a política de alocação de órgãos, já que órgãos em melhores condições poderiam ser transplantados preferencialmente em pacientes que a priori já tivessem risco aumentado de pior prognóstico pós-transplante. É muito cedo, porém, para afirmar que tal política tivesse qualquer resultado, já que ensaios clínicos controlados seriam necessários para determinar a utilidade de tal triagem.

Inflammasome-Independent Modulation of Cytokine Response by Autophagy in Human Cells

Post de Marcia Weber (LIP/CPqGM-FIOCRUZ)


A autofagia é um mecanismo conservado para a degradação de organelas defeituosas e proteínas com vida prolongada (1), sendo importante para a homeostasia da célula, na resposta biológica a situações de estresse, como fome e escassez de fatores de crescimento, em patologias, e na defesa do hospedeiro. No sistema imune ela pode ter três tipos de ações (2); na remoção direta de patógenos intracelulares, facilitando a apresentação de antígenos pelo MHC II e no suporte ao desenvolvimento de células T. No presente trabalho (3), Crisan e colaboradores avaliaram o papel da autofagia na produção de citocinas proinflamatórias em células humanas. Para isso, eles separaram PBMC por gradiente de Ficoll e as células foram incubadas na presença ou não de 3MA (inibidor do complexo Beclin-1 que inicia a autofagia), ou com inibidores de MEK, JNK ou p38. Em seguida, estas células foram estimuladas com LPS ou Pam3Cys (análogo do LPS que ativa macrófagos e monócitos) ou ainda LPS + ATP. Primeiramente, eles demonstraram que PBMC s tratados com 3MA apresentaram um aumento significativo na secreção de IL-1β e diminuição de TNF-α, porém nenhuma diferença foi encontrada na secreção de IL-10. Em seguida, eles avaliaram os níveis de expressão de RNAm por RT-PCR com resultados similares: um aumento nos níveis de transcrição de RNAm para IL-1β e diminuição de TNF-α na presença de 3MA. Assim, eles demonstram que a autofagia possui efeito modulatório importante na inflamação.
Por outro lado, já está bem estabelecido que o ATP, um ativador de inflamossoma, potencializa o processamento e liberação de IL-1β. PBMCs controle apresentaram aumento na produção de IL-1β na presença de ATP quando comparado com amostras tratadas com 3MA. Ao contrário do que se viu com células murinas, a autofagia não inibiu a ativação de inflamossoma em células humanas, reforçando as diferenças entre células humanas e murinas. Em experimentos adicionais, foi avaliado o efeito da fome, que induz a autofagia, na produção de citocinas. A fome inibiu a transcrição de IL-1β após estímulo com LPS ou Pam3Cys. O efeito da fome foi revertido na presença de 3MA, demonstrando um envolvimento da autofagia. Por fim, eles foram avaliar o papel de MAP kinases na modulação da inibição da autofagia pelo 3MA. Das células tratadas com inibidores de MEK, JNK ou p38, apenas na presença de p38 ocorreu uma diminuição na concentração de IL-1β, após estímulo com Pam3Cys. Todas as outras apresentaram aumento de IL-1B e diminuição de TNF alfa. Os autores sugerem que a ativação de p38 possui um papel importante para o efeito do 3MA no aumento da produção de L-1β.
Em conclusão, este foi o primeiro trabalho que investiga a modulação de citocinas inflamatórias pelo processo de autofagia em célula humana. Eles demonstraram que a inibição da autofagia possui impacto importante na modulação de citocinas, aumentando a secreção de IL-1β e diminuindo de TNF-α. Eles também demostraram que a ativação de inflamossoma não é influenciada em PBMC humano e que as mudanças observadas são exercidas em nível de transcrição gênica. A compreensão dos mecanismos de autofagia que regulam a inflamação pode trazer oportunidades para o entendimento e tratamento de doenças inflamatórias, como a doença de Crohn, por isso a importância deste trabalho.

1. Todde V et al; Autophagy: Principles and significance in health and disease. Biochim Biophys Acta 1792; 3-13.

2. Munz C (2009) Enhancing Immunity through autophagy. Annu Rev Immunik 27: 423-49.

3. Crişan, T., Plantinga, T., van de Veerdonk, F., Farcaş, M., Stoffels, M., Kullberg, B., van der Meer, J., Joosten, L., & Netea, M. (2011). Inflammasome-Independent Modulation of Cytokine Response by Autophagy in Human Cells PLoS ONE, 6 (4) DOI: 10.1371/journal.pone.0018666

Camundongos Balb/c infectados por L. braziliensis, isoladas de paciente refratário ao tratamento com antimônio, apresentam lesões graves devido à IL-4

Post de Rômulo Santiago (LIP/CPqGM-FIOCRUZ)

A leishmania braziliesis (Lb) é o principal agente etiológico da leishmaniose tegumentar no Brasil. Apesar disso, existem poucos trabalhos, utilizando modelo experimental, caracterizando a resposta imune desencadeada por este parasita, uma vez que os animais são geralmente resistentes à infecção. Esta resistência, assim como na infecção por L. major, está relacionada a uma forte resposta do tipo Th1. Então, para entender o que levaria a susceptibilidade à este parasita, os autores deste estudo desenvolveram um modelo no qual camundongos Balb/c foram infectados com L braziliensis isolada de pacientes susceptíveis LTCP15171(S) e resistentes LTCP393(R) ao tratamento com medicamentos à base de antimônio pentavalente (Sbv), os quais são utilizados como medicamentos de primeira escolha no tratamento desta doença no Brasil.
Os animais infectados com a Lb LTCP393(R) apresentaram lesões mais graves, com tempo de cura maior e aumento do número de parasitas no sítio da infecção quando comparados com os animais infectados com a Lb LTCP15171(S). Contudo, não foram observadas diferenças no infiltrado inflamatório local e nas citocinas do tipo Th1 (p. ex. INF-a). A única diferença observada foi a alta produção de IL-4 no sítio da lesão dos animais infectados pelo isolado de Lb resistente LTCP393(R), o que favoreceria a sobrevida do parasita e aumentaria a severidade da doença. A IL-4 é uma potente ativadora da enzima Arginase I que compete com o iNOS por L-arginina, diminuindo a síntese de NO, aumentando a quantidade do precursor ornitina, favorecendo a síntese de poliaminas para a Leishmania e, consequentemente, a sua proliferação. Assim, a imunomodulação da resposta Th2 induzida por certas cepas de Lb podem interferir no curso e severidade da doença.

Costa, D., Carregaro, V., Lima-Júnior, D., Silva, N., Milanezi, C., Cardoso, C., Giudice, �., de Jesus, A., Carvalho, E., Almeida, R., & Silva, J. (2011). BALB/c Mice Infected with Antimony Treatment Refractory Isolate of Leishmania braziliensis Present Severe Lesions due to IL-4 Production PLoS Neglected Tropical Diseases, 5 (3) DOI: 10.1371/journal.pntd.0000965